Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Summary

Una tecnica che utilizza alta risoluzione intavital microscopia a 2 fotoni di visualizzare direttamente e quantificare filtrazione gloemrular in glomeruli superficie. Questo metodo consente la determinazione diretta di caratteristiche di permeabilità di macromolecole in stati sia normali e malati.

Abstract

Malattie renali con perdita urinaria di grandi macromolecole essenziali, quali albumina sierica, sono stati a lungo pensato per essere causato da alterazioni nella permeabilità della barriera composto podociti, cellule endoteliali vascolari, e una membrana basale lavorano all'unisono. I dati ottenuti nel nostro laboratorio utilizzando intravital microscopia a 2 fotoni rivelato una più permeabile barriera di filtrazione glomerulare (ULA) di quanto si pensasse in condizioni fisiologiche, con il recupero di filtrato albumina che si verificano in un sottoinsieme precoce di cellule chiamate cellule del tubulo prossimale (PTC) ^{1,2, 3.}

Tecniche precedenti usate per studiare filtrazione renale e stabilendo la caratteristica della barriera di filtrazione coinvolto micropuntura del lume di questi segmenti tubolari primi con campionamento del fluido contenuto e analisi ^4. Questi studi determinata concentrazione di albumina nel fluido luminale essere praticamente inesistenti; corrispondente strettamentea quanto normalmente rilevata nelle urine. Tuttavia, la caratterizzazione dei polimeri di destrano con dimensioni definite da questa tecnica ha rivelato quelle di dimensioni simili all'albumina sierica avevano livelli più elevati nel lume tubulare e nelle urine; suggerendo un aumento della permeabilità ^5.

Qui è una descrizione dettagliata della tecnica utilizzata per visualizzare direttamente e quantificare glomerulare fluorescente permeabilità albumina in vivo. Questo metodo permette di individuare filtrata albumina attraverso la barriera di filtrazione nello spazio di Bowman (la camera iniziale di filtrazione urinaria), e permette anche la quantificazione di albumina riassorbimento dai tubuli prossimali e visualizzazione di successiva transcitosi albumina ^6. L'assenza di fluorescenza lungo albumina successivi segmenti tubolari in rotta alla vescica evidenzia l'efficienza del percorso di recupero nei segmenti tubulo prossimale precedenza. Inoltre, quando è stata applicata questa tecnica per determinare la permeabilitàdi destrani aventi dimensioni simili a valori di permeabilità praticamente identiche albumina sono stati segnalati ^2. Queste osservazioni supportano direttamente la necessità di ampliare l'attenzione di molte malattie renali proteinuriche ai inclusi alterazioni delle cellule del tubulo prossimale bonifica.

Protocol

1. Coniugazione di Rat albumina sierica di solfo-rodamina 101 Sulfonyl Cloruro (Texas Red) Sciogliere 100 mg di albumina sierica Rat (RSA) in 6,667 ml di 100 mM Sodio bicarbonato pH 9,0; concentrazione finale di 15 mg / ml in un tubo da 50 ml conica. Soluzione luogo in bicchieri di ghiaccio / acqua e raffreddare a tra 0-4 ° C. Aggiungere 200 ml di dimetilformammide anidra di alta qualità (DMF) per una fiala 10 mg di Texas Red Sulfonyl Cloruro (TRSC); vortice sul medio per 15 sec. <l…

Representative Results

La figura 3 mostra un esempio di immagine presa da un glomerulo superficie di un Munich Wistar Frömter ratto e le misure adottate per determinare la permeabilità di albumina fluorescente. Il valore GSC per l'albumina di 0,0111 derivato per questo autunno glomerulo individuo all'interno del campo visto in questo ceppo di Monaco ratti Wistar quando nella condizione alimentato 3. La stabilità visto in queste immagini è dovuta alla accurata progettazione e l'esecuzione di istruzio…

Discussion

I passaggi evidenziati qui rappresentano ciò che sentiamo di essere quelli che producono valori di permeabilità coerenti e precise, perché aggirano i seguenti problemi:

1. Scattering: L'uso di un rosso fluorofori che emettono permetterebbe una maggiore efficienza di raccolta della luce dal più fotoni di lunghezza d'onda sono meno inclini a disperdersi. Utilizzando sia fluorofori che emettono verdi o blu introdurrà maggiore variazione in GSC della causa della maggiore variabilità nei valori di int…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07