Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

Summary

Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

Abstract

Enfermedades renales que implican la pérdida urinaria de grandes macromoléculas esenciales, tales como albúmina de suero, durante mucho tiempo han sido pensado para ser causada por alteraciones en la barrera de permeabilidad compuesta de podocitos, células endoteliales vasculares, y una membrana basal de trabajo al unísono. Los datos de nuestro laboratorio utilizando microscopía intravital 2 fotones revelaron una barrera más permeable filtración glomerular (GFB) que se creía en condiciones fisiológicas, con la recuperación de la albúmina filtrada que ocurre en un subconjunto inicial de células llamadas células de los túbulos proximales (PTC) ^{1,2, 3.}

Las técnicas anteriores han usado para estudiar la filtración renal y el establecimiento de la característica de la barrera de filtración involucrados micropunción del lumen de estos primeros segmentos tubulares con el muestreo de los contenidos y el análisis de fluido ^4. Estos estudios determinaron la concentración de albúmina en el fluido luminal de ser prácticamente inexistente; corresponde estrechamentea lo que se detecta normalmente en la orina. Sin embargo, la caracterización de los polímeros de dextrano con tamaños definidos por esta técnica reveló los de un tamaño similar a la albúmina sérica tenían niveles más altos en el lumen tubular y la orina, sugiriendo aumento de la permeabilidad ^5.

En esto es un esquema detallado de la técnica utilizada para visualizar y cuantificar directamente glomerular fluorescente permeabilidad a la albúmina in vivo. Este método permite la detección de la albúmina filtrada a través de la barrera de filtración en el espacio de Bowman (la cámara inicial de la filtración urinaria), y también permite la cuantificación de la albúmina por la reabsorción de los túbulos proximales y la visualización posterior de transcitosis albúmina ^6. La ausencia de albúmina fluorescente a lo largo de los segmentos tubulares posteriores en la ruta a la vejiga pone de relieve la eficacia de la vía de recuperación en los segmentos proximales antes del túbulo. Por otra parte, cuando se aplica esta técnica para determinar la permeabilidadSe informó de dextranos que tienen un tamaño similar a los valores de permeabilidad virtualmente idénticos albúmina ^2. Estas observaciones apoyan directamente la necesidad de ampliar el foco de muchas enfermedades renales proteinúricas a modificaciones incluidas en la recuperación de células del túbulo proximal.

Protocol

1. Conjugación de albúmina de suero de rata Sulfo-rodamina 101 cloruro de sulfonilo (Rojo Texas) Disolver 100 mg de albúmina de suero de rata (RSA) en 6.667 ml de 100 mM de bicarbonato de sodio pH 9,0; concentración final 15 mg / ml en un tubo de 50 ml cónico. Solución Colocar en hielo / agua vaso de precipitados y se enfría a entre 0 y 4 ° C. Añadir 200 l de formamida dimetil alta calidad anhidra (DMF) a un vial de 10 mg de cloruro de sulfonilo Texas Red (TRSC); vórtice en el me…

Representative Results

La Figura 3 muestra un ejemplo de una imagen tomada de una superficie de un glomérulo Múnich Frömter rata Wistar y las medidas adoptadas para determinar la permeabilidad de la albúmina fluorescente. El valor GSC para la albúmina de 0.0111 deriva de este otoño glomérulo individual dentro del rango observado en esta cepa de ratas Wistar Munich cuando en el estado alimentado 3. La estabilidad se ve en estas imágenes es debido a la planificación y ejecución de las instrucciones represen…

Discussion

Los pasos que destacamos a continuación representan lo que sentimos al ser los que van a producir los valores de permeabilidad consistentes y precisos, ya que eludir las trampas siguientes:

1. Dispersión: El uso de un rojo fluoróforos que emiten permite una mayor eficiencia recaudatoria de la luz ya que los fotones de longitud de onda más largas son menos propensos a la dispersión. Utilizando cualquiera de fluoróforos que emiten verde o azul introducirá una mayor variación en el GSC de debido a la mayo…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07