En teknikk utnytte høy oppløsning intavital 2-foton mikroskopi å direkte visualisere og kvantifisere gloemrular filtrering i overflaten glomeruli. Denne metoden gjør det mulig for direkte bestemmelse av permeabilitet av makromolekyler i både normale og syke tilstander.
Kidney sykdommer som involverer tap av store urin-essensielle makromolekyler, slik som serumalbumin, har lenge vært antatt å være forårsaket av forandringer i permeabilitet barriere består av podocytes, vaskulære endotelceller, og en basalmembran arbeider i samklang. Data fra vårt laboratorium ved hjelp intravital 2-foton mikroskopi avslørte en mer gjennomtrengelig glomerulær filtrering barriere (GFB) enn tidligere antatt i henhold fysiologiske forhold, med henting av filtrert albumin forekommer i en tidlig undergruppe av celler som kalles proksimale tubulære celler (PTC) 1,2, 3.
Tidligere teknikker som brukes til å studere nyrefiltrasjon, etablere de karakteristiske for filtrerings-barriere involvert micropuncture av lumen av disse tidlige rørformede segmenter med prøvetaking av væskeinnhold og analyse 4.. Disse studier fastslått albuminkonsentrasjon i den luminale væske for å være praktisk talt ikke-eksisterende, tilsvarende tettmed det som normalt detekteres i urinen. Avslørte imidlertid karakterisering av dekstran polymerer med definerte størrelser til denne teknikken de av en størrelse lik serumalbumin hadde høyere nivåer i den rørformede lumen og urin; tyder økt permeabilitet 5..
Heri er en detaljert skisse av den teknikk som brukes til direkte å visualisere og kvantifisere glomerulær fluorescerende albumin permeabilitet in vivo. Denne metoden gjør det mulig for påvisning av filtrert albumin over filtrering barriere i Bowmans plass (den første kammer av urin filtrering), og også tillater kvantifisering av albumin reabsorpsjon av proksimale tubuli og visualisering av påfølgende albumin transcytosis seks. Fraværet av fluorescerende albumin sammen senere rørformede segmenter vei til blæren fremhever effektiviteten av henting veien i tidligere proksimale tubulære segmenter. Dessuten, når denne teknikken ble brukt bestemme permeabilitetav dextraner har en lignende størrelse til albumin nesten identiske permeabilitet verdier ble rapportert to. Disse observasjonene direkte støtter behovet for å utvide fokus for mange proteinuric nyresykdommer til inkluderte endringer i proksimale tubuli celle gjenvinning.
Trinnene uthevet her representerer hva vi føler for å være de som vil produsere konsistente og nøyaktige permeabilitet verdier fordi de omgå disse fallgruvene:
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Silvia B Campos-Bilderback og George J Rhodes for å fullføre kirurgiske prosedyrer som involverer plassering av venøs tilgang linjer. De ønsker også å takke Sara E Wean for å opprettholde München-Wistar kolonier som består av både Simonsen og Frömter stammer.
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |