Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor
Summary
En teknik som använder hög upplösning intavital 2-foton mikroskopi att direkt visualisera och kvantifiera gloemrular filtrering i ytan glomeruli. Denna metod möjliggör en direkt bestämning av permeabilitetsegenskaper makromolekyler i både normala och sjuka tillstånd.
Abstract
Njursjukdomar där urinen stora viktiga makromolekyler, såsom serumalbumin, har länge ansetts vara orsakade av förändringar i permeabilitetsbarriären består av podocytes, vaskulära endotelceller, och ett basalmembran arbetar unisont. Data från vårt laboratorium använder intravital 2-foton mikroskopi visade en mer permeabel barriär glomerulär filtration (GFB) än vad man tidigare trott under fysiologiska förhållanden, med hämtning av filtrerat albumin förekommer i ett tidigt delmängd av celler som kallas proximala tubuli-celler (PTC) 1,2, tre.
Tidigare tekniker som används för att studera njurfiltrationen och upprättande av karakteristiska för filtrering barriär som micropuncture av lumen av dessa tidiga rörformiga segment med provtagning av flytande innehåll och analys 4. Dessa studier bestäms albuminkoncentration i luminala vätskan att vara praktiskt taget obefintlig, motsvarande näramot vad som vanligtvis detekteras i urinen. Däremot avslöjade karakterisering av dextran polymerer med definierade storlekar från denna teknik de av en storlek som liknar serumalbumin hade högre nivåer i den rörformade lumen och urin, vilket tyder på ökad permeabilitet 5.
Häri finns en detaljerad beskrivning av den teknik som används för att direkt visualisera och kvantifiera glomerulär fluorescerande albumin permeabilitet in vivo. Denna metod möjliggör detektion av filtrerat albumin över filtreringen barriären i Bowmans utrymme (den inledande avdelningen av urin filtrering), och tillåter också kvantifiering av albumin reabsorption av proximala tubuli och visualisering av efterföljande albumin transcytos 6. Frånvaron av fluorescerande albumin längs senare rörformiga segment väg till blåsan belyser effektiviteten hos hämtning banan i de äldre proximala tubuli segment. Dessutom, när denna teknik tillämpades bestämma permeabilitetav dextraner med en liknande storlek som albumin nästan identiska permeabilitetsvärden rapporterades 2. Dessa observationer stöder direkt behovet av att utöka fokus för många proteinuri njursjukdomar till inkluderade förändringar i proximala tubuli cell regenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stegen markerade här representerar vad vi anser vara de som kommer att producera konsekventa och korrekta permeabilitetsvärden eftersom de kringgå följande fallgropar:
- Spridning: Användningen av en röd emitterande fluoroforerna möjliggöra mer effektiv uppsamling av ljus eftersom längre våglängd fotoner är mindre benägna att sprida. Använda antingen gröna eller blå avger fluoroforer kommer att införa större variation i generalsekretariatet på grund av ökad variabilitet i intensitet värde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Silvia B Campos-Bilderback och George J Rhodos för att slutföra kirurgiska ingrepp som omfattar placering av linjer venös tillgång. De skulle också vilja tacka Sara E avvänja för att upprätthålla de Munich-Wistar kolonier bestående av både Simonsen och Frömter stammar.
Materials
| Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
| Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
| Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
| Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
| Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
| Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
| High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
References
- Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
- Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).
- Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
- Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
- Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).
