ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化
Summary
技術が直接表面糸球体でgloemrularろ過を視覚化し、定量化するために、高解像度intavital 2光子顕微鏡を用いた。このメソッドは、正常および病的両方の状態における高分子の透磁率特性を直接測定することができます。
Abstract
例えば、血清アルブミンなどの大型不可欠巨大分子の尿中損失を伴う腎疾患は、長い足細胞、血管内皮細胞、および一斉に作業基底膜からなる透過バリアの変化によって引き起こされると考えられてきた。生体2光子顕微鏡を用いた我々の研究室からのデータは、フィルタアルブミンの取得は、近位尿細管細胞（PTC）1,2、と呼ばれる細胞の初期のサブセットに生じると、以前に生理的条件下では考えられていたよりも透過性の糸球体濾過障壁（GFB）を明らかにした3。
腎臓のろ 過および流体内容と分析4のサンプリングでこれらの初期の管状セグメントの内腔の微小穿刺を関与ろ過障壁の特性を確立することを研究するために使用前のテクニック。密接に対応し、これらの研究は事実上存在しないことを腔液のアルブミン濃度を決定する通常は尿中に検出されるものである。しかし、この技術によって定義されたサイズを有するデキストランポリマーの特徴付けは、血清アルブミンと同様のサイズのものを明らかにした管状の管腔および尿中のより高いレベルを持っていた。透過性の増大5を示唆している。
ここでは、直接生体内での糸球体蛍光アルブミン透過性を可視化し、定量化するために使用される技術の詳細な概要です。この方法は、ボーマンスペース（尿ろ過の初期室）にろ過関門フィルタリングアルブミンの検出を可能に、そしてまた近位尿細管およびその後アルブミントランス6の可視化により、アルブミン再吸収の定量が可能になります。膀胱への途中後で管状セグメントに沿って蛍光アルブミンが存在しないことは、以前の近位尿細管セグメントにおける検索経路の効率を強調しています。さらに、この技術を適用したときの浸透性を決定するアルブミン実質的に同一の透過性値に類似した大きさを有するデキストランの2を報告した。これらの観察結果は、直接、近位尿細管細胞の埋め立てに含まれる改変には多くの蛋白尿腎疾患の焦点を拡大する必要性をサポートしています。
Protocol
Representative Results
Discussion
手順はここで我々は、彼らが次の落とし穴を回避するため、一貫性のある正確な透過性値が生成されたものであると感じるものを表す強調：
- 散乱：長い波長の光子が散乱しにくい傾向があるので、赤色発光蛍光体の使用は、光をより効率的に回収を可能にする。どちら緑色または青色発光蛍光団を使用するので、毛細血管ループとボーマン空間3からの強度値の増加変動GSC年…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、静脈アクセスラインの配置を伴う外科手術を完了するため博士シルビアBカンポス-BilderbackとジョージJロードスに感謝したいと思います。彼らはまた、シモンセンとFrömter株の両方で構成されるミュンヘンのWistarコロニーを維持するためにサラE離乳に感謝したいと思います。
Materials
| Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
| Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
| Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
| Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
| Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
| Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
| High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
References
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