Summary
Den vanligaste metoden för att generera ett stort antal autologa dendritiska celler (DC) för användning i tumörimmunterapi beskrives. Metoden använder IL-4 och GM-CSF att skilja DCs från monocyter. De omogna DC stimuleras att mogna och sedan lastas med antigener innan de injiceras tillbaka in i patienten.
Abstract
Medan kliniska studier har visat att antigen-laddade DC vacciner är säkra och lovande terapi för tumörer 1, förblir deras kliniska effekt som skall fastställas. Metoden som beskrivs nedan, upprättats i enlighet med Good Manufacturing Process (GMP) riktlinjer, är en optimering av de vanligaste ex vivo förberedelse metod för att generera ett stort antal DCs för kliniska studier 2.
Vår metod utnyttjar den syntetiska TLR 3 agonist Polyinosinic-polycytidylsyra Acid-poly-L-lysin Karboxymetylcellulosa (Poly-ICLC) för att stimulera utvecklingsländerna. Vår tidigare studie visat att Poly-ICLC är den mest potenta individuell mognad stimulans för mänskliga DCs som bedömt av en uppreglering av CD83 och CD86, induktion av interleukin-12 (IL-12), tumörnekrosfaktor (TNF), interferon-gamma-inducerad protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) och typ I interferoner (IFN), och minimal interleukin 10 (IL-10) produktion. Utvecklingsländerna är differentierade från frusna perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhålls genom leukaferes. PBMC isoleras genom Ficoll gradientcentrifugering och frystes i alikvoter. Vid dygn 1, är PBMC tinades och plattades på vävnadsodlingskolvar för att selektera för monocyter som vidhäftar till plastytan efter 1-2 timmars inkubering vid 37 ° C i vävnadsodlingsinkubator. Efter inkubation lymfocyterna tvättas bort och de vidhäftande monocyterna odlas under 5 dagar i närvaro av interleukin-4 (IL-4) och granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) att differentiera till omogna DC. På dag 6, är omogna DC pulsade med keyhole limpet hemocyanin (KLH)-protein som fungerar som en kontroll för kvaliteten av vaccinet och kan öka immunogeniciteten hos vaccinet 3. DCS stimuleras att mogna, laddad med peptidantigener, och inkuberades över natten. På dag 7, tvättas cellerna, och frystes i alikvoter om 1 ml innehållande4-20 x 10 6 celler med användning av en kontrollerad-rate frys. Lot frisläppande för partier av DCs utförs och måste uppfylla minimikraven innan de injiceras i patienter.
Protocol
Ett. Isolering och frysförvaring av PBMC 4
- Aseptiskt spika en av accesspunkterna hamnar i leukaferes väskan med hjälp av en uppsättning plasma överföring. Med hjälp av en 60 ml spruta, överför leukaferes erhållits från patienter i en steril 500 ml flaska.
- Justera volymen för leukaferes till 2x sin ursprungliga volym med RPMI rumstemperatur. Blanda väl.
- Blanda försiktigt flaskan med Ficoll-Paque PLUS. Tillsätt 12 ml Ficoll-Paque PLUS i sterila 50 ml koniska rör.
- Försiktigt skiktet 30 ml av den utspädda leukaferes produkt till varje steril 50 ml koniskt rör innehållande Ficoll. Var noga med att inte störa gränsytan mellan Ficoll och cellsuspensionen.
- Upprepa steg 1,3 och 1,4 tills allt leukaferes har skiktades.
- Centrifugera 50 ml koniska rör vid 1000 x g under 20 min vid rumstemperatur utan broms.
- Försiktigt skörda grumlig skiktet av PBMC från varje rör och transfer till nya sterila 50 ml rör.
- Lägg RPMI till varje rör till en slutlig volym av 50 ml. Blanda försiktigt genom inversion.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g under 10 min vid 4 ° C med full bromsverkan.
- Avlägsna supernatanterna från varje rör. Resuspendera cellen pellets från varje rör och tillsätt RPMI till en slutlig volym av 50 ml. Blanda försiktigt genom inversion.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g under 6 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanterna från varje rör. Återsuspendera och pool tillsammans cellsuspensionerna i en 50 ml koniska rör.
- Ta volymen av de poolade PBMC upp till 50 ml med mer RPMI. Blanda försiktigt genom inversion.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g under 6 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 50 ml RPMI. Blanda försiktigt för att säkerställa en enhetlig cellsuspension.
- Räkna antalet celler och bestämma cellviabiliteten. Beräkna det totala antalet viabla celler.
- Centrifugera cellerna vid 300X g under 6 min vid 4 ° C. Förbered frysmediet. Frysning medier består av 10% dimetylsulfoxid (DMSO; Miltenyi Biotec) i humant AB-serum (Valley Biomedical).
- Avlägsna supernatanten. Resuspendera cellerna vid en slutlig koncentration av 2 x 10 8 celler / ml i kalla frysmediet.
- Gör portioner om 1 ml i 1,8 ml cryovials.
- Överför cryovials i kontrollerad takt frys och börja frysa loppet, Program 1. Vid slutet av körningen, överföra frysta cryovials omedelbart in i gasfasen av flytande kväve frysen.
2. Dag 0: Differentiering av dendritiska celler från monocyter
- Tillsätt 30 ml RPMI / 1% autolog plasma till en steril 50 ml koniska rör.
- Tina portioner av frysta PBMC genom varsam omrörning i 37 ° C vattenbad. När den är helt upptinad, överföra innehållet i flaskorna till sterila 50 ml koniska rör. Blanda väl.
- Centrifugera cellerna under 6 minvid 500 x g vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera de pelleterade cellerna i en liten volym av RPMI / 1% autologt plasma. Tillsätt sedan mer RPMI / 1% autolog plasma till en slutlig volym av 50 ml. Blanda väl.
- Centrifugera cellerna igen för 6 min vid 500 x g vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 50 ml RPMI / 1% autolog plasma. Blanda väl.
- Räkna antalet celler och bestämma cellviabiliteten. Beräkna det totala antalet viabla celler.
- Plate 1,40 x 10 8 celler i 40 ml RPMI / 1% autolog plasma på 225 cm 2 EasyFlask. Upprepa tills alla celler har ströks.
- Inkubera EasyFlasks platta på dess sida för 1 - 2 timmar vid 37 ° C i vävnadsodling inkubator innehållande 5% CO2 för att tillåta monocyterna att vidhäfta till kolven.
- När inkubationen är klar, ta bort EasyFlask från kuvösen och tvätta två gånger för att avlägsna de icke-vidhäftande celler USIng 30 ml förvärmd RPMI.
- Efter den andra sköljningen, tillsätt 40 ml RPMI / 1% autolog plasma med 400-1000 lU / ml IL-4 och 100-1.000 lU / ml GM-CSF 5-8. För detta protokoll använder vi 400 IU / ml IL-4 och 100 IU / ml GM-CSF.
- Inkubera EasyFlasks för två dagar vid 37 ° C i vävnadsodling inkubator innehållande 5% CO2.
Tre. Dag 2: Utfodring av dendritiska celler med IL-4 och GM-CSF
- Tillsätt 4 ml RPMI / 1% autolog plasma med 400-1000 lU / ml IL-4 och 100-1.000 lU / ml GM-CSF till varje EasyFlask. Blanda genom att snurra och gunga på sin sida.
- Inkubera EasyFlasks för tre fler dagar (fram till dag 5) vid 37 ° C i vävnadsodling inkubator innehållande 5% CO2.
4. Dag 5: Skörd av omogna dendritceller
- Skörda kulturerna genom kraftig virvling kolvarna och genom att pipettera upp och ner för att resuspendera icke vidhäftande och löst vidhäftande celler. Överförskördade cellerna till nya 50 ml koniska rör.
- Centrifugera rören vid 500 xg under 6 min vid rumstemperatur. Ta supernatanterna och suspendera cellpelleten i 50 ml RPMI / 1% autolog plasma. Blanda väl.
- Räkna antalet celler och bestämma cellviabiliteten. Beräkna det totala antalet viabla celler.
- Centrifugera rören vid 500 xg under 6 min vid rumstemperatur. Plate 1-2 x 10 6 celler per brunn i 3 ml RPMI / 1% autolog plasma med 400 lU / ml IL-4 och 100 lU / ml GM-CSF i 6-brunnars vävnadsodlingsplattor.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i vävnadsodling inkubator innehållande 5% CO2 över natten.
Fem. Dag 6: Mognad och Antigen laddas av dendritiska celler
- Lägg 10 mikrogram / ml KLH till 1/3 av brunnarna i 6-brunnar. Swirl plattorna att blanda. KLH är endast till 1/3 av brunnarna eftersom KLH används endast för första DC-vaccinet. Efterföljande DC vacciner conbehålla endast de tumör antigenpeptider.
- DCs kan stimuleras att mogna med hjälp av olika stimuli. De vanligaste mognad stimuli som har använts i kliniska studier har varit en cocktail av cytokiner (IL-1 β, TNFa och IL-6) och prostaglandin E2 (PGE 2) 9,10. På senare tid har användningen av Toll-like receptor (TLR) agonister vunnit popularitet 11,12. I detta protokoll, tillsätt 2 mg / ml Polyinosinic-polycytidylsyra Acid-poly-L-lysin Karboxymetylcellulosa (Poly-ICLC) till brunnarna och blanda väl. Poly-ICLC är den kliniska kvalitet formulering av Poly-IC som är stabiliserad med poly-L-*-lysin och karboximetylcellulosa (tillverkad av Oncovir, Inc.).
- Tillsätt 100 | ig / ml långa antigener peptid (NY-ESO-1 och / eller Melan-A/MART-1) till deras utsedda brunnar, varje brunn ta emot endast en enda peptid för att undvika korsvis konkurrens 13.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i vävnadsodling inkubator innehållande 5% CO <sub> 2 O / N.
6. Dag 7: Frysförvaring av dendritiska celler
- Förbered DC fryser med autolog plasma och 10% DMSO. Centrifugera DC Frysning Lösning på 2000 x g under 20 min vid 4 ° C för att avlägsna eventuellt partikelformigt material. Överför supernatanten till ett nytt märkt 15 ml koniska rör. Förvara vid 4 ° C fram till användning.
- När natten inkubation är klar, skörd och pool alla brunnar innehållande DC pulsade med peptiderna i 50 ml koniska rör.
- Centrifugera rören vid 500 xg under 6 min. Avlägsna överstående. Resuspendera cellpelleten i 5 ml RPMI / 1% autologt plasma. Ta med den totala volymen upp till 50 ml med RPMI / 1% autologt plasma. Blanda väl.
- Räkna antalet celler och bestämma cellviabiliteten. Beräkna totala antalet viabla celler.
- Centrifugera rören vid 500 xg under 6 min vid rumstemp. Ta supernatanterna och återsuspendera varje pellet i 5 ml sterile 0,9% NaCl, USP och överföring till nya 15 ml koniska rör. Ta varje cellsuspension till 14 ml med mer steril 0,9% NaCl, USP. Cap och blanda genom inversion.
- Upprepa föregående steg två gånger. Efter den sista centrifugeringen, avlägsna supernatanterna, att komma så nära som möjligt till cellen pellets utan att störa pellets.
- Resuspendera cell pellets i DC fryser vid 4 - 20 x 10 6 celler / ml och delprov 1 ml till vardera 1,8 ml CryoTube injektionsflaska.
- Använd kontrollerad takt frys, Program 1, för att frysa ner portioner av DC-vaccin och överföra direkt till ångfas av en flytande kväve frys för långtidsförvaring.
7. Lot frisläppande
- Varje sats av DC-vaccin måste utvärderas och uppfylla särskilda kriterier lot release (tabell 1) innan det släpps för injektion i patienter i studien, vanligtvis 5 till 6 veckor efter vaccinet förberedelser.
- Viabilitet:Utvärdera lönsamheten för DC-vaccin med en automatiserad cellräknare. Den lägsta godtagbara livskraft specifikationen är> 70%.
- Identitet: Utvärdera identiteten för den mogna DCs (CD11c + CD14-CD83 +) genom flödescytometri. Procentandelen CD11c + celler bör vara> 50%. Andelen CD11c + och CD14 + celler bör vara <30% och andelen CD11c +, CD14-och CD83 +-celler bör vara> 50%.
- Sterilitet: Test DC vaccin för förekomst av anaeroba och aeroba bakterier och svamp genom direkt kultur och fläckar Gram. Utvärdera för närvaro av mykoplasma med användning av en direkt odlingssystem och DNA fluorokrom färgning Assay med indikator-cellinje. För dessa tester är den minsta specifikationen uppsättning som ingen tillväxt observeras från alla kulturer.
- Endotoxin: Utvärdera endotoxinhalten med Kinetic-QCL kinetisk kromogen LAL-analys och det måste vara <50 EU / ml för att uppfylla de minimikrav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mellan 10 - 20% av utgångsmaterial PBMC differentieras till DC i slutet av kulturen period. Mogna DCs är CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, och CCR7 + (Figur 1). De uttrycker höga nivåer av MHC klass I-och Il-molekyler och molekylerna samstimulerande CD80 och CD86. Poly-ICLC inducerade också lägre nivåer av PDL-1 jämfört med andra TLR agonister 14. Dessutom dessa Poly-IC-mognat DCs utsöndrar stora mängder av IL-12 (figur 2 och 15,16) och inducerar proliferation av allogena T-celler (Figur 3).
Figur 1. Representant fenotypen av fullt differentierade DCs mognat med Poly-IC. Samtliga DCs var gated på fram-och sido-spridningsdiagram. DCs identifierades etts CD11c + och CD14-. Mognad av DCs svar på Poly-ICLC (tjock linje) utvärderades baserat på uttrycket av CD83, CD40, och CCR7 och jämfört med stimulerade DCs (gråtonad). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. DCs mognat med Poly-IC producerar höga nivåer av cytokiner. Supernatanter från DCs särskiljas från 3 friska givare uppsamlades efter över natten mognad av DC: er med poly-IC. Cytokiner produceras mättes genom Cytokine Bead Array (CBA) Människa inflammatoriska cytokiner Kit (BD Biosciences) som mäter IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β, och IL-8.
rc = "/ files/ftp_upload/50085/50085fig3.jpg" />
Figur 3. DCs mognat med Poly-ICLC inducera proliferation av allogena T-celler. Poly-ICLC-mognat DCs från friska donatorer inkuberades 1:10 med Carboxyfluorescein diacetat succinimidylester (CFSE)-märkta allogena T-celler. Efter 6 dagar var proliferation (A) utvärderades genom flödescytometri genom grindning på CD3 + T-cellpopulationen. X-axeln visar utspädning av CFSE, som ett mått på spridning i de olika sam-odlingsbetingelser: T-celler ensam, ostimulerad DC, Poly-ICLC stimulerade DC, och fytohemagglutinin (PHA)-stimulerade T-celler. Cytokinutsöndring (B) under proliferation utvärderades från supernatanterna i de kulturer som använder BD CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II (BD Biosciences) som mäter IFNy, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, och IL-2. Endast IFNy visas som de andra cytokiner inte upptäcktes till mätbara nivåer i analysen./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
| Test | Metod | Kriterier |
| Viabilitet | Guava Personlig Cell Analysis med ViaCount Reagens | > 70% |
| Identitet | Flödescytometri -% CD11c + celler | > 50% |
| Flödescytometri -% CD11c + CD14 + celler | <30% | |
| Flödescytometri -% CD11c + CD14-CD83 + celler | > 50% | |
| Sterilitet | Bakteriella och svampkulturer | Negativ |
| Mycoplasma: Direkt Cell Culture | Negativ | |
| Endotoxin | Kinetic Kromogena LAL-analys | <50 EU / ml |
| Funktion | Blandad lymfocytreaktion | Rapport Resultat |
Tabell 1. Lot Release Kriterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fas I och II kliniska prövningar av monocythärledda DCs har visat att de inducerar immunsvar hos patienter men klinisk framgång har begränsats 1. Detta kan delvis bero på att det saknas enighet om hur man skapar de optimala DCs för tumör immunotherapeutic bruk. Även om det finns många sätt att generera klinisk-grade DCs, dessa metoder varierar i termer av användningen av cytokiner som används för att differentiera monocyter, stimuli som används för att inducera mognad, och metoder för antigen lastning. Formeln för att generera optimala DC återstår att definieras 2.
Nya in vitro-studier har visat att DCs mognat med en cocktail av proinflammatoriska cytokiner 10, som har använts i de flesta kliniska prövningar, särskilt förekomsten av PGE2, kan inducera differentiering av reglerande T-celler och Th2 svar 17, Express IDO 18, och har brist på IL-12p70produktion 19. Dessa effekter undergräver avsevärt vaccinets förmåga att inducera immunsvar och därmed stödja behovet att utvärdera alternativa metoder för förfallande DCs i syfte att optimera deras effekter in vivo.
Användningen av TLR-agonister, särskilt TLR 3 agonist Poly-IC, att mogna DCS kan förbättra den kliniska effekten av DCs. In vitro studier har visat att Poly-IC-mognat DCs behöll stabilt högt uttryck av MHC-molekyler och CD83 och samstimulerande molekyler CD40, CD80, och CD86 14,15,20. Dessutom, Poly-IC-mognat DCs producerade höga nivåer av IL-12 14,16,20, en viktig cytokin för generering av anti-tumor svar 21, liksom andra proinflammatoriska cytokiner såsom TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10, och typ I IFN: er 14. Ännu viktigare, har som visats i murina tumörmodeller, DCs pulserade med humant papillomvirus (HPV) antigener och mognat wed Poly-IC-primade cytotoxiska T-cell svar var kapabla att utrota etablerade HPV16-uttryckande tumörer 22. Som mognaden status DCs och förekomsten av IL-12 verkar korrelera med effekt i kliniska prövningar 23,24, kan användningen av Poly-IC till mogna DCs vara ett viktigt steg mot att uppnå målet med klinisk framgång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har fått ekonomiskt stöd från följande: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 och K08 AI084578 (Miller)), Bill och Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliansen för Lupus Research, och Emerald Foundation. Nina Bhardwaj är en coinventor om patent för framställning och användning av dendritiska celler för att manipulera immunitet. Författarna har inga andra relevanta tillhörighet eller ekonomiska engagemang med någon organisation eller enhet med ett finansiellt intresse i eller finansiell konflikt med ämnet eller material som diskuteras i manuskriptet bortsett från dem som beskrivs.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Andres Salazar (Oncovir, Inc.) för gåvan av Poly-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O'Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants? Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
