Summary
腫瘍免疫療法に使用するための自己樹状細胞（DC）を大量に生成するための最も一般的に使用される方法が記載されている。この方法は、単球から樹状細胞を区別するためにIL-4およびGM-CSFを使用する。彼らは患者に再び注入される前に、未成熟DCは、成熟した後、抗原でロードに刺激される。
Abstract
臨床研究は、抗原·ロードDCワクチンは腫瘍1のための安全かつ有望な治療法であり、それらの臨床的有効性が確立されて残っていることが確立しているが。方法は、良好な製造技術（GMP）のガイドラインに準拠して作成、後述するように、臨床研究のためのDC 2を大量に生成するための最も一般的なex vivoでの調製方法の最適化である。
提案手法では、樹状細胞を刺激するための合成TLR 3アゴニストポリイノシン - ポリシチジル酸 - ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を利用する。 CD83およびCD86のアップレギュレーションにより評価されるポリICLCはヒトDCのための最も強力な個々の成熟刺激であることが確立我々の以前の研究では、インターロイキン12の誘導（IL-12）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロンγ誘起タンパク質10（IP-10）、interleukmin 1（IL-1）、I型インターフェロン（IFN）、および最小のインターロイキン10（IL-10）産生。 樹状細胞は、白血球搬出により得られた凍結末梢血単核細胞（PBMC）から区別される。 PBMCを、フィコール勾配遠心分離によって単離し、アリコートで凍結する。 1日目では、PBMCを解凍され、℃の中の組織培養インキュベーターで、37〜2時間インキュベートした後、プラスチック表面に付着した単球を選択するために組織培養フラスコに播種。インキュベーション後、リンパ球が洗い落とされ、接着単球を未成熟DCに分化するインターロイキン-4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の存在下で5日間培養する。 6日目に、未成熟DCは、ワクチンの品質の制御として機能し、ワクチン3の免疫原性を高めることがキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）タンパク質でパルスされています。 DCは、成熟に刺激ペプチド抗原を搭載し、一晩インキュベートする。 7日目に、細胞を洗浄し、含有する、1mlのアリコートで凍結4 -制御された速度冷凍庫を使って20×10 6細胞。 DCのバッチのロットリリーステストが行われ、それらが患者に注入される前に、最低限の仕様を満たしている必要があります。
Protocol
1。 PBMCを4の単離と凍結保存
- 無菌スパイクプラズマ転送セットを使用して、白血球搬出袋のアクセスポートのいずれ。 60ミリリットル注射器を用いて、無菌の500mlボトルに患者から得られた白血球搬出を転送する。
- 室温RPMIを用いて元のボリュームを2倍に白血球搬出の音量を調整します。徹底的に混ぜる。
- 優しくフィコール - Paque PLUSのボトルを混ぜて。滅菌50ミリリットルコニカルチューブに12ミリリットルフィコール - Paque PLUSを追加します。
- フィコールを含む各滅菌50ミリリットルコニカルチューブに希釈白血球搬出製品の優しく層30ミリリットル。フィコールと細胞懸濁液との間のインターフェースを邪魔しないように注意してください。
- 白血球搬出のすべてが積層されるまで手順1.3と1.4を繰り返します。
- ブレーキなしで室温で20分間、1,000×gで50ミリリットルコニカルチューブを遠心。
- 慎重に各チューブとtransfe由来のPBMCの濁った層を収穫新しい無菌の50mlチューブにR。
- 50ミリリットルの最終体積に各チューブにRPMIを追加します。反転により穏やかに混合。
- 4時10分°Cフルブレーキ付、500×gで、細胞を遠心分離します。
- 各チューブから上清を取り除きます。各チューブからの細胞ペレットを再懸濁し、50 mlの最終容積にRPMIを追加します。反転により穏やかに混合。
- 500×4で6分間遠心℃で細胞を遠心
- 各チューブから上清を取り除きます。再懸濁し、1 50ミリリットルコニカルチューブに一緒にプールに細胞懸濁液を。
- もっとRPMIで50 mlにプールされた末梢血単核球の体積を持ち出す。反転により穏やかに混合。
- 300×4で6分間遠心℃で細胞を遠心
- 上清を取り除きます。 50ミリリットルRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。均一な細胞懸濁液を確実にするために穏やかに混合する。
- セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
- 300で細胞を遠心×4で6分間遠心℃、凍結メディアを準備します。ヒトAB血清（バレーバイオメディカル）において、凍結培地は、10％ジメチルスルホキシド（DMSOミルテニーバイオテク社）で構成されています。
- 上清を取り除きます。寒い凍結メディアで2×10 8細胞/ mlの最終濃度で細胞を再懸濁します。
- 1.8ミリリットルのクライオバイアルに1ミリリットルのアリコートを作る。
- 制御された速度冷凍庫にクライオバイアルに移し、凍結実行、プログラム1を開始します。実行の最後に、直ちに液体窒素冷凍庫の気相に凍結クリオバイアルを移す。
2。 0日目：単球から樹状細胞の分化
- 滅菌50ミリリットルコニカルチューブにRPMI / 1％自己血漿30mlのを追加します。
- 37℃の水浴中で穏やかに撹拌によって凍結したPBMCの融解アリコート。完全に解凍すると、無菌の50ミリリットルコニカルチューブにバイアルの内容を転送します。徹底的に混ぜる。
- 6分間、細胞を遠心分離室温で500×gで。上清を除去し、RPMI / 1％自己血漿少量のペレット化した細胞を再懸濁します。次いで50 mlの最終容積にもっとRPMI / 1％自己血漿を追加します。徹底的に混ぜる。
- 500で6分×gで室温では再び細胞を遠心分離。上清を吸引し、50ミリリットルRPMI / 1％自己血漿でペレットを再懸濁します。徹底的に混ぜる。
- セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
- プレート1.40 40 RPMIのミリリットル/ 225センチメートル2 EasyFlaskへ1％自家血漿中×10 8細胞。すべての細胞がメッキされているまで繰り返します。
- 1のためにその側にフラットEasyFlasksをインキュベート- 37で2時間°組織培養インキュベーターでCは単球がフラスコに付着できるように、5％CO 2を含む。
- インキュベーションが完了したら、インキュベーターからEasyFlaskを除去し、非接着細胞USIを除去するために二回洗っNG温めRPMI 30mlの。
- 二回目の洗浄後、400〜1,000 IU / mlのIL-4および100〜1,000 IU / mlのGM-CSF 5-8でRPMI / 1％自己血漿40 mlを加える。このプロトコルのために、我々は400 IU / mlのIL-4、100 IU / mlのGM-CSFを使用しています。
- 37℃で2日間EasyFlasksをインキュベート°組織培養インキュベーター中でCが5％CO 2を含む。
3。 2日目：IL-4およびGM-CSFを有する樹状細胞の給餌
- 400〜1,000 IU / mlのIL-4および100〜1,000 IU / mlのGM-CSFで各EasyFlaskにRPMI / 1％自己血漿4 mlを加え。渦巻くとその側に揺動混ぜる。
- 37℃の組織培養インキュベーター中、5％CO 2を含むでより多くの3日間EasyFlasksを（5日まで）インキュベートする。
4。 5日目：未成熟樹状細胞の収穫
- 精力的にフラスコを渦巻くことで、非粘着性と緩く接着細胞を再懸濁するために上下にピペッティングにより文化を収穫。転送新しい50 mlコニカルチューブに回収した細胞。
- 室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。上清を取り出し、50ミリリットルRPMI / 1％自己血漿で細胞ペレットを再懸濁します。徹底的に混ぜる。
- セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
- 室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。 3ミリリットルRPMI / 6ウェル組織培養プレートで400 IU / mlのIL-4および100 IU / mlのGM-CSFと1％の自己血漿中のウェル当たりプレート1-2×10 6細胞。
- 37℃でプレートをインキュベート℃で組織培養インキュベーターでは2晩、5％のCOを含む。
5。 6日目：樹状細胞の成熟と抗原読み込み
- 10μgの/ mlのKLHに6ウェル培養プレート中のウェルの1/3を入れる。渦巻プレートが混合する。 KLHにのみ第1のDCワクチンに使用されるためKLHは、ウェルの1/3に添加する。その後のDCワクチンの詐欺唯一の腫瘍抗原ペプチドをTainの。
- DCは異なる刺激を使用して成熟し刺激することができる。臨床試験で用いられている最も一般的な成熟刺激サイトカインのカクテル（IL-1β、TNFαおよびIL-6）及びプロスタグランジンE2（PGE 2）9,10されている。より最近では、Toll様受容体（TLR）アゴニストの使用は人気11,12を集めている。このプロトコルでは、ウェルに2 mg / mlのポリイノシン-ポリシチジル酸-ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を追加し、よく混ぜる。ポリICLCは、ポリ-L-*-リジンおよびカルボキシメチルセルロース（Oncovir社製）で安定化されているポリ-ICの臨床グレードの製剤である。
- 各ウェルクロス競争13を回避する唯一の単一のペプチドを受け、それらの指定されたウェルには100μg/ mlの長いペプチド抗原（NY-ESO-1および/ またはMelan-A/MART-1）を追加します。
- 37℃のプレートをインキュベートし、組織培養におけるCインキュベーターがCO 5％を含む<サブ> 2 O / N
6。 7日目：樹状細胞の凍結保存
- 自己血漿および10％DMSOを使用してDC凍結溶液を調製。任意の粒子状物質を除去するために4℃で20分間2,000のDC凍結ソリューション×gで遠心します。新しいラベル15ミリリットルコニカルチューブに上清を移します。 4℃で保存し、使用するまでC。
- 一晩のインキュベーションが終了し、収穫、プール50ミリリットルコニカルチューブにペプチドをパルスした樹状細胞を含むすべての井戸。
- 6分間500×gでチューブを遠心する。上清を取り除きます。 RPMI / 1％自己血漿5mlの細胞ペレットを再懸濁します。 RPMI / 1％自己血漿で50 mlに総量を持ち出す。徹底的に混ぜる。
- セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
- 室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。上清を取り出し、5ミリリットル殺菌の各ペレットを再懸濁しル0.9％のNaCl、USPおよび新しい15ミリリットルコニカルチューブに移す。より滅菌0.9％のNaCl、USPは14 mlに各細胞懸濁液を持参してください。反転によってキャップとミックス。
- 二回前の手順を繰り返します。最後の遠心分離後、上清を除去し、ペレットを乱すことなく、細胞ペレットにできるだけ近くになって。
- 4のDC凍結溶液中の細胞ペレットを再懸濁し- 20×10 6細胞/ mlとアリコートそれぞれ1.8ミリリットルのクライオチューブバイアルに1ミリリットル。
- DCワクチンのアリコートを下に凍結し、長期保存のために液体窒素冷凍庫の気相中にすぐに転送するために、制御された速度冷凍庫、プログラム1を使用します。
7。ロットリリーステスト
- それは典型的には5〜6週間ワクチン調製後、研究では患者への注射のためにリリースされる前に、DCワクチンの各バッチが評価され、特定のロットリリース基準（ 表1）を満たしている必要があります。
- 生存：自動細胞計数器を用いたDCワクチンの有効性を評価する。最小許容生存仕様は> 70％である。
- アイデンティティ：フローサイトメトリーによる成熟DC（CD11cは+ CD14-CD83 +）の身元を評価する。のCD11c +細胞の割合は> 50％であるべきである。 CD11c陽性の割合は+およびCD14 +細胞が<30％のCD11c +、の割合がCD14-、およびCD83 +細胞がなければならない>ことが50％。べき
- 不妊：直接文化やグラムの汚れで嫌気と好気性細菌や真菌の存在のためのテストのDCワクチン。インジケータセルラインと直接培養系及びDNA蛍光色素染色アッセイを用いてマイコプラズマの存在を評価します。これらのテストでは、最小の仕様セットは成長がすべての培養物から観察されないということである。
- エンドトキシン：キネティック-QCLカイネティック発色LALアッセイを用いてエンドトキシンの内容を評価し、それが最低基準を満たすために<50 EU / mlのでなければなりません。
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Representative Results
10との間 - 出発したPBMCの20％は培養期間の終了時にDCへと分化する。成熟DCはあるのCD11c +、CD14-、CD83 +、CD40 +、およびCCR7 +（ 図1）。それらは、MHCクラスIおよびII分子および共刺激分子CD80およびCD86の高いレベルを発現する。他のTLRアゴニスト14と比較して、ポリICLCまた、PDL-1の低レベルを誘導した。さらに、これらのポリIC-成熟DCを分泌する大IL-12の量（ 図2及び15,16）とは、同種T細胞（ 図3）の増殖を誘導する。
図1。ポリ-ICと成熟完全に分化したDCの代表的な表現型。すべてのDCは、前方と側方散乱プロットにゲートだった。樹状細胞が同定されたSのCD11c +およびCD14-。ポリICLCに応じてDCの成熟（太線）CD83、CD40、およびCCR7の発現に基づいて評価され、刺激されていない樹状細胞（灰色濃淡）と比較した。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 DCは、ポリICはサイトカインの高いレベルを生成と成熟。3健康なドナーから分化したDCからの上清は、ポリ-ICとDCの一晩熟成した後に採取した。産生されるサイトカインは、サイトカインビーズアレイ（CBA）を用いて測定したヒト炎症性サイトカインIL-12p70を、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β及びIL-8を測定するキット（BD Biosciences社）。
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図3。 DCは同種T細胞の増殖を誘導するポリICLCで成熟。ポリICLC-成熟健康なドナーからのDCをカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（CFSE）で標識された同種異系T細胞と1時10分インキュベートした。 6日後、増殖（）CD3 + T細胞集団にゲーティングすることによって、フローサイトメトリーにより評価した。 X軸は、増殖の測定値として、CFSEの希釈を示し、様々な共培養条件下で：T細胞だけでは、DC、ポリICLC刺激DC、およびフィトヘマグルチニン（PHA）で刺激したT細胞を刺激していない。サイトカイン分泌は、（B）増殖中にIFNγを測定するBD CBA人間のTh1/Th2サイトカインキットII（BD Biosciences社）、TNF、IL-10、IL-6、IL-4を使用して培養上清からの評価を行ったとIL-2。他のサイトカインは、アッセイで測定可能なレベルには検出されなかったとしてだけIFNγが表示されます。/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
| テスト | 方法 | 基準 |
| 生存能力 | ViaCount試薬とグアバ個人的細胞解析 | > 70％ |
| アイデンティティ | フローサイトメトリー - ％のCD11c +細胞 | > 50％ |
| フローサイトメトリー - ％のCD11c + CD14 +細胞 | <30％ | |
| フローサイトメトリー - ％のCD11c + CD14-CD83 +細胞 | > 50％ | |
| 不妊 | 細菌および真菌培養 | 負 |
| マイコプラズマ：直接細胞培養 | 負 | |
| エンドトキシン | キネティック·発色LALアッセイ | <50 EU / mlの |
| 機能 | 混合リンパ球反応 | 報告結果 |
表1。ロットリリース基準。
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Discussion
フェーズIおよびIIは、単球由来樹状細胞の臨床試験は、患者しかしながら、臨床的成功は1に限定されているにおける免疫応答を誘導することが示されている。これは、腫瘍免疫療法用に最適DCを生成する方法に関するコンセンサスが不足している一因であってもよい。臨床グレードのDCを生成する多数の方法があるが、これらの方法は、単球、成熟を誘導するために使用される刺激、および抗原負荷のメソッドを区別するために使用されるサイトカインの使用の点で異なる。最適なDCを生成するための式は、依然として2で定義されていない。
in vitro試験では、最近のDCは、臨床試験の大部分で使用されている炎症性サイトカインのカクテルで10成熟特にPGE2の存在は、制御性T細胞およびTh2応答17、明白なIDOの分化を誘導することが示されている18、及びIL-12p70のに不十分である生産19。これらの効果は、有意な免疫応答を誘導するため、in vivoでその効果を最適化するために、成熟DCの代替法を評価する必要性をサポートするワクチンの能力を損なう。
DCを成熟するTLRアゴニストの使用、特にTLR 3アゴニストポリ-IC、DCの臨床的有効性を改善することができるが。vitro試験では、ポリIC-成熟DCは安定した高MHC分子の発現とCD83を保持していることが示されている共刺激分子CD40、CD80、およびCD86 14,15,20。また、ポリIC-成熟DCは、IL-12 14,16,20、高レベルの抗腫瘍応答21、並びにTNF-αのような他の炎症性サイトカイン、IL-6の生成のための重要なサイトカインを産生さIL-1β、IP-10、I型は14型IFN。マウス腫瘍モデルにおいて示されているようなより重要なのは、樹状細胞は、ヒトパピローマウイルス（HPV）抗原をパルス及びwの成熟i番目のポリIC-プライミング細胞傷害性T細胞応答は、確立されたHPV16を発現している腫瘍22を根絶することができた。樹状細胞の成熟状態とIL-12の存在は、臨床試験において有効性23,24と相関して見えるように、成熟DCにポリ-ICを使用することは臨床的成功の目標を達成に向けた重要な一歩かもしれない。
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Disclosures
NIH（AI061684、AI071078、AI044628、およびK08 AI084578（ミラー））、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団、ドリス·デューク慈善財団、がん研究所、ループス研究のための同盟、そしてエメラルド：著者は、次の中から財政支援を受けている財団。ニーナBhardwajは、免疫力を操作するために、樹状細胞の調製および使用に関連した特許に関する共同発明者である。著者らは、他の関連する提携または任意の組織または団体の金融関心を持つか、または離れて開示されているものから原稿で議論主題または材料と金融紛争を有する金融関わりを持っていません。
Acknowledgments
著者らは、ポリICLCの贈り物のためにアンドレスサラザール（Oncovir株）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
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