Real-time Analyser af Retinol Transport af membranen Receptor af Plasma retinolbindingsprotein

Summary

Her beskriver vi en optimeret teknik til at producere høj kvalitet vitamin A / RBP kompleks og to real-time overvågning teknikker til at studere vitamin A transport med STRA6, det RBP receptoren.

Abstract

Vitamin A er afgørende for vision og vækst / differentiering af næsten alle menneskelige organer. Plasma retinol-bindingsprotein (RBP) er princippet og specifik bærer af vitamin A i blodet. Her beskriver vi en optimeret teknik til at producere og oprense holo-RBP og to real-time overvågning teknikker til at studere transporten af ​​vitamin A ved høj affinitet RBP receptor STRA6. Den første teknik gør det muligt at fremstille en stor mængde af høj kvalitet holo-RBP (100%-fyldt med retinol) for vitamin A transport assays. Høj kvalitet RBP er afgørende for funktionelle assays, fordi fejlfoldede RBP udgivelser vitamin A let og bakteriel forurening i RBP forberedelse kan forårsage artefakter. Real-time overvågning teknikker som elektrofysiologi har gjort kritiske bidrag til studier af membran transport. Den RBP receptormedieret retinol transport er ikke blevet analyseret i realtid indtil for nylig. Den anden teknik er beskrevet her, er real-time analyse af STRA6-katalyseret retinol frigivelse eller læsning. Den tredje teknik er realtidsanalyse af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til cellulært retinol bindingsprotein I (CRBP-I). Disse teknikker giver høj følsomhed og opløsning i afslørende RBP receptors vitamin A optagelse mekanisme.

Introduction

Vitamin A er et organisk molekyle, der er afgørende for menneskets overlevelse og et velfungerende næsten alle menneskelige organer. Vitamin A derivater (retinoider) deltage i diverse biokemiske og cellulære begivenheder, herunder sensing af lys til syn ^1,2 og reguleringen af genekspression og protein translation under fosterudviklingen og i voksent væv ^3-6. Selv retinol har evnen til at diffundere systemisk, evolution kom op med plasma retinol-bindende protein, et specifikt bærerprotein for vitamin A transport i blodet for at opnå en høj effektivitet og specificitet og undgå toksicitet forbundet med tilfældig diffusion ^7-10. Et højaffinitets-receptoren, som binder til RBP og fylder vitamin A Hypotesen var i 1970'erne ^11-13. Trods beviser akkumuleret i tre årtier på eksistensen af RBP receptor ^14-31 blev receptor hypotese debatteret i mange år på grund af existence af en forkert definition af holo-RBP. Den korrekte definition af holo-RBP er, at det er den høje affinitet 1:1 kompleks mellem retinol og RBP. Gentagen ekstraktion af holo-RBP af organisk opløsningsmiddel er nødvendig til at producere Apo-RBP. Denne definition anvendes af næsten alle laboratorier studerer RBP ^7,9,32-35 eller RBP-receptoren ^14-31,36-42. Den forkerte definition af holo-RBP der blev brugt til modbevise eksistensen af ​​RBP-receptoren er den akutte blanding af fri retinol med apo-RBP. Eftersom funktionen af ​​RBP receptoren i vitamin A optagelse fra holo-RBP er at frigøre retinol fra holo-RBP ville RBP-receptoren spiller nogen rolle i retinol optagelse hvis retinol er fri til at begynde med (som foreslået af urigtige afgrænsning af holo -RBP).

Den nylige identifikation af RBP receptor som multitransmembrane domæne protein kaldet STRA636 og dets funktion i vitamin A optagelse fra holo-RBP ^36-43 kraftigt taler imod den hypotese, at RBP ikke erbrug for en receptor til at levere vitamin A. Detaljerede analyser afslørede, at STRA6 har 9 transmembrane domæner med N-terminalen er placeret ekstracellulært, og C-terminus placeret intracellulært ^40. Placeret mellem transmembran 6 og 7 er en væsentlig RBP bindingsdomæne ^39. STRA6 er koblet til både LRAT og CRBP-I i vitamin A optagelse fra holo-RBP, men hverken LRAT eller CRBP-I er absolut nødvendig for øget STRA6 aktivitet ^41. STRA6 evne til at katalysere retinol frigivelse fra holo-RBP er nøglen til dets vitamin A optagelsesaktivitet ^41. Ved at lægge STRA6 at frigive sit retinol, kan vitamin A levering af RBP transportere vitamin A til målceller i perifere væv med høj specificitet og effektivitet.

Den afgørende betydning af holo-RBP definition og forberedelse illustreres ikke kun af historisk debat om eksistensen af ​​RBP-receptoren, men også af tre beslægtede seneste artikler baseret på holo-RBP definitioner DIFskellige fra den oprindelige og korrekte definition ^44-46. Det første papir holo-RBP definition, der blev anvendt til at afvise eksistensen af RBP receptoren at undersøge RBP receptor ^44. Den anden og tredje papirer kom op med en tredje definition af holo-RBP der gjorde det endnu mindre sandsynligt for retinol, som skal undersøges for at danne en ordentlig kompleks med RBP ^45,46. Disse undersøgelser prepared ³ H-retinol/RBP ved blanding af holo-RBP (ikke engang apo-RBP) ^med 3H-retinol. Eftersom dette assay ikke havde ³ H-retinol/RBP dannet og ikke unødigt ^frit 3H-retinol ^45,46, er det ikke et assay for ^3H-retinol optagelse fra ³ H-retinol/RBP, men er en fri ^3H-retinol diffusion assay. Det er blevet vist tidligere, at STRA6 ikke forøge cellulær optagelse af frit retinol ved LRAT ³⁸ eller CRBP-I ^41. Stort set al retinol er bundet til RBP i blodet, og der er ingen påviselig free retinol. En hovedfunktion RBP-receptoren er at katalysere retinol frigivelse fra holo-RBP under retinol optagelse fra holo-RBP ^41. Hvis retinol kunstigt frigives eller er i fri form til at begynde med ^45,46 er RBP-receptoren ikke nødvendigt. De dramatisk forskellige resultater, som frit retinol diffusion assay i sammenligning med assays baseret på korrekt forberedt holo-RBP illustrerer, at korrekt tilberedning af RBP er afgørende for dets funktionelle assays.

RBP kan oprenses fra humant serum ^41, men fremgangsmåden er kompleks, og udbyttet er lavt. En alternativ fremgangsmåde er at fremstille RBP i E. coli. Da E. coli ikke har evnen til korrekt folde mammale secernerede proteiner med mere end ét par af disulfidbindinger som RBP, er det vigtigt at refold RBP og oprense korrekt foldede protein. Fejlfoldede proteiner ikke alene opfører sig forskelligt fra korrigeret foldede RBP i forskellige analyser,men også forårsage proteinaggregering under opbevaring. Af samme grund er apo-RBP kun fremstillet af høj kvalitet holo-RBP. Vi beskriver her en optimeret protokol til at producere høj kvalitet RBP 100% fyldt med retinol gennem bakteriel ekspression, genfoldning, og HPLC-oprensning. HPLC-oprensning ikke kun fjerner ukorrekt foldet RBP men også betydelig bakteriel forurening, der kan forårsage alvorlige artefakter hvis RBP bruges i signaltransduktionsinhibitorer assays. Vi beskriver også to følsomme real-time overvågning teknikker til at studere retinol transport af STRA6. Begge teknikker afhænger af høj kvalitet RBP. På grund af pladsbegrænsninger, de klassiske teknikker til radioaktiv retinoid-baseret og HPLC-baseret vitamin A uptake assays er ikke beskrevet her.

Protocol

1. Produktion, Refoldning, og HPLC-oprensning af holo-RBP Transform BL-21cells med pET3a vektor, der huser cDNA'et for human RBP med 6x His-mærke på N-terminalen. Dyrke de transformerede BL-21-celler i et rysteapparat ved 37 ° C i 40 ml LB-medium med carbenicillin, indtil OD ved 600 nm når 0,5. Inducere RBP-proteinekspression ved tilsætning af IPTG til 1 mM. Dyrke bakterierne ved 37 ° C endnu 5 timer. RBP produceret i E. coli er for det meste til stede i uopløselige inklusionsleg…

Representative Results

Vi præsenterer her repræsentative resultater for holo-RBP produktion og oprensning ved HPLC (fig. 1), real-time analyse af STRA6-katalyseret retinol frigivelse fra holo-RBP og retinol påfyldning i apo-RBP (fig. 2) og tidstro analyse af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til EGFP-CRBP-I (figur 3). Uden genfoldning, fremstillet RBP i bakterier er næsten fuldstændigt fejlfoldede på grund af tilstedeværelsen af ​​mange u…

Discussion

Vi deler her en optimeret RBP produktion protokol fordi RBP produktion og oprensning procedurer er afgørende for at skabe korrekt foldet RBP. Have mulighed for fejlfoldede RBP arter og tilstedeværelsen af ​​spormængder af bakterielle proteiner selv i HPLC-oprenset bakterier producerede RBP, er det nyttigt at anvende nativt RBP fra serum for at bekræfte en konklusion vedrørende RBP. Urin RBP, som er kommercielt tilgængelig, er en kompleks blanding af mange arter af RBP herunder apo-RBP-og holo-RBP ^48,49.</…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655