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Biology

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

여기 고품질의 비타민 A / RBP의 복잡하고 STRA6, RBP 수용체가 비타민에게 교통편을 공부하는 두 실시간 모니터링 기술을 생산하는 최적의 기술을 설명합니다.

Abstract

비타민 A는 시력을 위해 필수적이며, 성장 / 거의 모든 인간의 장기 차별화. 플라즈마 레티놀 결합 단백질 (RBP)은 혈액의 원칙과 비타민의 특정 항공사입니다. 우리는 여기 생산하고 고친 화성 RBP 수용체 STRA6에 의한 비타민 A의 전송을 공부하고 홀로 RBP와 두 개의 실시간 모니터링 기술을 정화 할 수있는 최적화 된 기술을 설명합니다. 첫 번째 기술은 가능한 고품질 비타민에 홀로 RBP (100 레티놀과 %로드) A 교통 assays의 대량 생산 할 수 있습니다. RBP 자료 비타민 RBP 준비에 쉽게와 세균 오염 유물을 일으킬 수 misfolded 있기 때문에 우수한 품질의 RBP는 기능 assays를위한 필수적입니다. 전기 생리학 등의 실시간 모니터링 기술은 막 수송의 연구에 중요한 공헌을 만들었습니다. RBP 수용체 – 매개 레티놀 전송은 실시간으로 최근까지 분석되지 않았습니다. 여기에 설명 된 두 번째 기술은 정말이에요이다STRA6 – 촉매 레티놀 자료 나로드의 L-시간 분석. 세 번째 기술은 홀로 RBP에서 세포의 레티놀 결합 단백질 I (CRBP-I)에 STRA6 – 촉매 레티놀 전송의 실시간 분석이다. 이 기술은 RBP 수용체의 비타민 A 이해 메커니즘을 드러내는 높은 감도와 해상도를 제공합니다.

Introduction

비타민 A는 인간의 생존과 거의 모든 인간의 장기의 적절한 작동을 위해 필수적이며 유기 분자이다. 비타민 A 유도체 (retinoids)는 비전 1,2 및 배아 발달 동안과 성인 조직 3-6 유전자 발현과 단백질 번역 조절을위한 빛의 감지 등 다양한 생화학 및 세포의 행사에 참여하고 있습니다. 레티놀이 체계적으로 확산 할 수있는 능력을 가지고 있지만, 진화는 플라즈마 레티놀 결합 단백질, 비타민 높은 효율성과 특이성을 달성하고 7-10 임의의 확산과 관련된 독성을 피하기 위해 혈액에서 교통에 대한 특정 캐리어 단백질을 세웠 어. RBP에 바인딩과 비타민을 차지 고친 화성 수용체가이 1970 년대 11-13에 가설되었다. RBP 수용체 14-31의 존재에 세 수십 년 동안 축적 된 증거에도 불구하고, 수용체 가설 인해 existenc에 몇 년 동안 논의되었습니다홀로 RBP의 잘못된 정의 5. 홀로 RBP의 올바른 정의는 레티놀과 RBP 사이의 높은 연관성 1:1 복잡한 것입니다. 유기 용매에 의한 홀로 RBP의 반복 추출 APO-RBP를 생성 할 필요가 있습니다. 이 정의는 RBP 7,9,32-35 또는 RBP 수용체 14-31,36-42를 공부 거의 모든 실험실에서 사용됩니다. RBP 수용체의 존재를 증명하는 데 사용 된 홀로 RBP의 잘못된 정의는 APO-RBP 무료로 레티놀의 급성 혼합입니다. 비타민의 RBP 수용체의 기능 때문에 홀로 RBP의 이해는 홀로 RBP의 레티놀을 공개하는 것입니다 레티놀은 (같은 홀로그램의 잘못된 정의에 의해 제안으로 시작하는 무료있는 경우, RBP 수용체는 레티놀 이해에 더 역할을하지 않을 – RBP).

multitransmembrane 도메인 단백질 등의 RBP 수용체의 최근 식별이 STRA636 전화를 비타민에서의 기능은 홀로 RBP 36-43에서 호응을 강력히 RBP하지 않는 가설에 대한 주장STRA6이 intracellularly 40에 위치한 구 transmembrane의 extracellularly있는 N-말단과 도메인과 C-말단를 가지고 계시 비타민 A. 자세한 분석을 제공하는 수용체가 필요합니다. transmembrane 6과 7 사이에 위치한 것은 필수 RBP 구속력을 도메인 39입니다. STRA6는 LRAT과 비타민 홀로 RBP의 이해에 CRBP-I 모두에 커플 링하지만, LRAT도도 CRBP-I는 절대적으로 강화 STRA6 활동을 41 필요합니다.합니다 홀로 RBP에서 레티놀 자료를 catalyze하는 STRA6의 능력은 비타민 A 통풍 관 활동을 41의 핵심입니다. 의 레티놀을 발표 할 STRA6에 의존함으로써, 비타민 RBP의 게재는 비타민 A 높은 특이성과 효율성과 주변 조직의 세포를 타겟팅 할 수송 할 수 있습니다.

홀로 RBP 정의와 준비의 중요한 중요성은 홀로 RBP 정의 DIF에 따라 세 관련 최근 논문으로도 RBP 수용체의 존재에 대한 역사적 논쟁이 아니라 그림이되지만,원본과 올바른 정의 44-46에서 ferent. 첫 번째 논문은 RBP 수용체에게 44 공부를 할 수있는 RBP 수용체의 존재를 승인하는 데 사용 된 홀로 RBP 정의를 사용했습니다. 두 번째 및 세 번째 논문은 훨씬 가능성이 레티놀에 대한 공부를했다 RBP 45,46과 적절한 복잡한을 형성하기 위해 만든 홀로 RBP의 세 번째 정의를 내놓았다. 이 연구는 3 H-레티놀과 함께 홀로 RBP를 (도 못 APO-RBP) 혼합하여 3 H-retinol/RBP을 준비했습니다. 이 분석 3 H-retinol/RBP이 형성되고 과도한 무료 3 H-레티놀 45,46를 제거하지 않은이 없었 때문에, 3 H-retinol/RBP에서 3 H-레티놀의 이해를위한 분석되지는 않지만 무료입니다 3 H-레티놀 확산 분석. 그것은 STRA6이 LRAT 38 또는 CRBP-I 41에서 무료로 레티놀의 세포 이해를 강화하지 않는 이전에 표시되어 있습니다. 거의 모든 레티놀은 혈액에 RBP에 바인딩되며 감지가 fre 없습니다전자 레티놀. RBP 수용체의 주요 기능은 홀로 RBP 41에서 레티놀의 이해 동안 홀로 RBP에서 레티놀 출시를 catalyze하는 것입니다. 레티놀은 인위적으로 발표 또는 45,46로 시작하는 자유 형식에 경우, RBP 수용체가 필요하지 않습니다. 올바르게 홀로 RBP는 RBP의 올바른 준비를 보여주는 준비에 따라 assays에 비해 무료 레티놀 확산 분석에서 얻은 크게 다른 결과는 기능 assays에 대한 중요합니다.

RBP는 인간의 혈청 41에서 정화하지만, 절차는 복잡하고 수율이 낮 될 수 있습니다. 다른 방법은 E.에 RBP을 생산하는 것입니다 대장균. 때문에 E. 대장균이 제대로 RBP 같은 이황화 채권의 하나 이상의 쌍 포유류의 분비 단백질을 접는 할 수있는 능력이 없습니다, 그것은 refold RBP와 올바르게 접혀 단백질을 정화하는 것이 필수적입니다. Misfolded 단백질은 다르게 다양한 assays에서 수정 접힌 RBP에서 동작하지뿐만 아니라, 저장 중 단백질 집계을 유발할 수 있습니다. 같은 이유로, APO-RBP은 높은 품질의 홀로 RBP에서 생산된다. 우리는 고품질의 RBP에게 세균 표현, refolding 및 HPLC 정화를 통해 레티놀과 함께로드 100 %를 생산하려면 여기를 최적화 프로토콜을 설명합니다. HPLC 정화가 잘못 접 RBP뿐만 아니라, RBP는 신호 전달의 assays에 사용하는 경우 심각한 유물을 일으킬 수 있습니다 중요한 세균 오염을 제거뿐만 아니라. 우리는 또한 STRA6으로 레티놀 전송을 공부하는 두 민감한 실시간 모니터링 기술을 설명합니다. 두 기술은 고품질의 RBP에 따라 달라집니다. 공간 제한으로 인해 방사능 retinoid 기반 및 HPLC 기반 비타민의 고전 기법을 이해의 assays는 여기에서 설명하지 않습니다.

Protocol

1. 홀로 RBP의 생산, Refolding 및 HPLC 정화 pET3a 벡터는 N-말단에 6x 그의 태그로 인간의 RBP에 대한 cDNA를 숨겨와 BL-21cells을 변환 할 수 있습니다. 600 nm의에서 OD까지 carbenicillin 40 ML의 LB 미디어에서 37 ° C에서 흔드는의 변화 BL-21 세포를 성장 0.5에 도달합니다. 1mM에 IPTG를 추가하여 RBP 단백질 식을 유도. 37 박테리아를 성장 ° C 앞으로 5 시간. E.coli에서 생산 RBP는 불용성 포함 기관의 ?…

Representative Results

우리는 홀로 RBP와 레티놀을로드하는 APO-RBP로 (그림 2)와 실시간 분석에서 STRA6 – 촉매 레티놀 자료의 HPLC에 의한 홀로 RBP 생산 및 정화 (그림 1), 실시간 분석을 보시려면 여기를 대표 결과를 제공 홀로 RBP에서 EGFP-CRBP-I에 STRA6 – 촉매 레티놀 전송 (그림 3). 거의 대부분 잘못된 이황화 채권의 존재로 인해 misfolded됩니다 refolding없이, RBP는 박테?…

Discussion

RBP 생산 및 정화 절차를 제대로 접 RBP을 생성에 중요한 때문에 우리는 여기서 최적화 된 RBP 생산 프로토콜을 공유 할 수 있습니다. misfolded RBP 종의 가능성과 RBP를 세균 제작도 HPLC 정화에 세균 단백질의 추적 금액의 존재 감안할 때, 그것은 RBP에 관한 결론을 확인하기 위해 혈청에서 기본 RBP를 사용하는 도움이됩니다. 상업적으로 사용할 수 있습니다 소변 RBP는 APO-RBP와 홀로 RBP 48,49 등의 RBP…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

건강 기금 R01EY018144 국립 연구소에 의해 지원.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
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References

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Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
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