Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Summary

Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.

Abstract

La vitamina A è essenziale per la visione e la crescita / differenziazione di quasi tutti gli organi umani. Plasma Retinol Binding Protein (RBP), è il principio e il supporto specifico di vitamina A nel sangue. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per produrre e purificare olo-RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare il trasporto di vitamina A per il recettore ad alta affinità RBP STRA6. La prima tecnica permette di produrre una grande quantità di alta qualità holo-RBP (100%-caricato con retinolo) per la vitamina A saggi trasporto. RBP di alta qualità è essenziale per saggi funzionali perché misfolded RBP comunicati vitamina A contaminazione batterica prontamente e in preparazione RBP può causare artefatti. In tempo reale, come le tecniche di monitoraggio elettrofisiologico hanno dato un contributo critico agli studi di trasporto di membrana. Il recettore-mediata RBP trasporto retinolo non è stato analizzato in tempo reale fino a poco tempo. La seconda tecnica qui descritta è la ragionel analisi in tempo STRA6-catalizzata rilascio retinolo o il carico. La terza tecnica è analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto retinolo da olo-RBP di proteina cellulare che si lega al retinolo (CRBP-I). Queste tecniche offrono l'elevata sensibilità e risoluzione nel rivelare recettore della vitamina RBP di un meccanismo di assorbimento.

Introduction

La vitamina A è una molecola organica che è essenziale per la sopravvivenza umana e il corretto funzionamento di quasi tutti gli organi umani. Derivati ​​della vitamina A (retinoidi) partecipare a diversi eventi biochimici e cellulari tra cui il rilevamento della luce per ^1,2 visione e la regolazione dell'espressione genica e della traduzione di proteine ​​durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti ^3-6. Sebbene retinolo ha la capacità di diffondere sistemica, evoluzione avvicinò con proteine ​​plasmatiche retinolo legante, una proteina carrier specifico per la vitamina A trasporto nel sangue per ottenere alta efficienza e specificità e per evitare la tossicità associata con diffusione casuale ^7-10. Un recettore ad alta affinità che si lega alla RBP e riprende vitamina A è stato ipotizzato nel 1970 ^11-13. Nonostante le prove accumulate in tre decenni l'esistenza del recettore RBP ^14-31, l'ipotesi del recettore è stata discussa per molti anni a causa della existence di una definizione errata di olo-RBP. La corretta definizione di holo-RBP è che è l'alta affinità complesso 1:1 fra retinolo e RBP. Estrazione ripetuta di olo-RBP di solvente organico è necessario per la produzione di apo-RBP. Questa definizione è utilizzata da quasi tutti i laboratori che studiano RBP ^7,9,32-35 o il recettore RBP ^14-31,36-42. La definizione errata di olo-RBP, che è stato utilizzato per confutare l'esistenza del recettore RBP è la miscela acuta di retinolo libero con apo-RBP. Poiché la funzione del recettore RBP di vitamina A assorbimento da olo-RBP è quello di rilasciare retinolo da olo-RBP, il recettore RBP avrebbe giocato alcun ruolo nella captazione retinolo se retinolo è libero di cominciare (come proposto dalla definizione errata di holo -RBP).

La recente identificazione del recettore RBP come una proteina di dominio multitransmembrane chiamato STRA636 e la sua funzione di assorbimento di vitamina A da olo-RBP ^36-43 sostiene con forza contro l'ipotesi che RBP nonbisogno di un recettore per fornire vitamina A. dettagliate analisi ha rivelato che STRA6 ha 9 domini transmembrana con l'N-terminale extracellulare e situati C-terminale situati intracellularmente ^40. Situato tra transmembrana 6 e 7 è un dominio di legame essenziale RBP ^39. STRA6 è accoppiato sia LRAT e CRBP-I di vitamina A assorbimento da olo-RBP, ma né LRAT né CRBP-I è assolutamente necessaria per una maggiore attività STRA6 ^41. STRA6 capacità di catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP è la chiave per la sua attività di assorbimento di vitamina A ^41. Facendo affidamento su STRA6 per rilasciare il suo retinolo, vitamina A consegna entro il RBP in grado di trasportare la vitamina A per colpire le cellule nei tessuti periferici, con elevata specificità ed efficienza.

L'importanza cruciale di olo-RBP definizione e la preparazione è dimostrata non solo dal dibattito storico sulla esistenza del recettore RBP, ma anche da tre documenti relativi recenti basate su olo-RBP definizioni difdifferenti dalla definizione originale e corretta ^44-46. Il primo documento utilizzato l'olo-RBP definizione che è stato utilizzato per disapprovare l'esistenza del recettore RBP per studiare il recettore RBP ^44. I documenti secondo e terzo avvicinò con una terza definizione di holo-RBP che ha reso ancora meno probabile per retinolo essere studiati per formare un complesso con adeguata RBP ^45,46. Questi studi preparato ^tre H-retinol/RBP mescolando olo-RBP (nemmeno apo-RBP) con ³ H-retinolo. Poiché questo dosaggio non ha avuto ³ H-retinol/RBP formata e non rimuovere eventuale eccessivo ³ H-retinolo ^45,46, non è un saggio per ³ H-retinolo assorbimento da ³ H-retinol/RBP, ma è un libero ³ H-retinolo diffusione dosaggio. E 'stato dimostrato in precedenza che STRA6 non aumenta l'assorbimento cellulare di retinolo libero da LRAT ³⁸ o CRBP-I ^41. Praticamente tutti retinolo è associato RBP nel sangue e non vi è rilevabile free retinolo. Una delle principali funzioni del recettore RBP è catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP durante l'assorbimento retinolo da olo-RBP ^41. Se il retinolo è artificialmente rilasciato o è in forma libera per cominciare ^45,46, il recettore RBP non è necessaria. I risultati notevolmente diversi ottenuti dal test gratuito diffusione retinolo rispetto alle analisi basate su preparato correttamente olo-RBP dimostrano che una corretta preparazione di RBP è di fondamentale importanza per i suoi saggi funzionali.

RBP può essere purificata da siero umano ^41, ma il procedimento è complesso e la resa è bassa. Un approccio alternativo è quello di produrre RBP in E. coli. Perché E. coli non ha la capacità di piegamento corretto mammiferi proteine ​​secrete con più di una coppia di legami disolfuro come RBP, è essenziale RBP ripiegare e purificare la proteina correttamente ripiegata. Proteine ​​mal ripiegate non solo si comportano diversamente da correggere RBP piegato in vari metodi,ma anche causare aggregazione di proteine ​​durante la conservazione. Per la stessa ragione, apo-RBP viene prodotta solo da alta qualità olo-RBP. Descriviamo qui un protocollo ottimizzato per la produzione di RBP di alta qualità 100% loaded con retinolo attraverso l'espressione batterica, ripiegamento, e la purificazione HPLC. Purificazione HPLC non solo rimuove RBP piegato in modo non corretto, ma anche significativa la contaminazione batterica che può causare artefatti gravi se RBP è utilizzato in saggi di trasduzione del segnale. Abbiamo anche descrivere due sensibili in tempo reale tecniche di monitoraggio per lo studio dei trasporti retinolo STRA6. Entrambe le tecniche dipendono RBP alta qualità. Per motivi di spazio, le tecniche classiche di vitamina radioattivo a base di retinoidi e HPLC-based A dosaggi di assorbimento non sono descritte qui.

Protocol

1. Produzione, ripiegamento, e Purificazione HPLC di Holo-RBP Trasforma BL-21cells con il vettore pET3a ospitare il cDNA per RBP umano con la sua etichetta 6x sulla N-terminale. Crescono le trasformate BL-21 celle in un agitatore a 37 ° C in media ml 40 LB con carbenicillina fino OD a 600 nm raggiunge 0,5. Indurre l'espressione della proteina RBP con l'aggiunta di 1 mM IPTG a. Crescere i batteri a 37 ° C un altro 5 ore. RBP prodotto in E. coli è presente soprattutto nei corpi di …

Representative Results

Presentiamo qui i risultati rappresentativi per olo-RBP produzione e purificazione mediante HPLC (Figura 1), analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP e carico retinolo in apo-RBP (Figura 2) e analisi in tempo reale di STRA6-catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP per EGFP-CRBP-I (Figura 3). Senza ripiegamento, RBP prodotta in batteri è quasi completamente misfolded per la presenza di numerosi legami disolfu…

Discussion

Condividiamo qui un protocollo ottimizzato di produzione RBP perché RBP procedure di produzione e di purificazione sono fondamentali per la generazione di RBP correttamente piegato. Data la possibilità di specie RBP misfolded e la presenza di tracce di proteine ​​batteriche anche in HPLC purificato batteri-RBP prodotte, è utile utilizzare RBP nativa da siero per confermare una conclusione relativa a RBP. RBP urina, che è disponibile in commercio, è una miscela complessa di molte specie di RBP tra apo-RBP e olo-…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655