JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Burada yüksek kaliteli vitamin A / RBP karmaşık ve STRA6, RBP reseptör tarafından A vitamini ulaşım incelemek için iki gerçek zamanlı izleme teknikleri üretmek için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar.

Abstract

A vitamini görme için gerekli olan ve büyüme / neredeyse bütün insan organlarının farklılaşması. Plazma retinol bağlayıcı protein (RBP) A kan ilke ve vitamin belirli taşıyıcısıdır. İşte biz üretmek ve yüksek afinite RBP reseptör STRA6 tarafından A vitamini ulaşım incelemek için holo-RBP ve iki gerçek zamanlı izleme teknikleri arındırmak için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar. İlk teknik mümkün yüksek kaliteli vitamini için holo-RBP (100 retinol ile% yüklenmiştir) A ulaşım testlerinin büyük miktarda üretmek için yapar. RBP bültenleri vitamini RBP hazırlanmasında bir kolaylıkla ve bakteriyel kontaminasyon eserler neden olabilir katlanan çünkü Yüksek kalite RBP fonksiyonel testleri için gereklidir. Elektrofizyoloji gibi Gerçek zamanlı izleme teknikleri membran taşıma çalışmaları için kritik katkılarda bulunmuşlardır. RBP reseptör-aracılı retinol taşıma gerçek zamanlı olarak yakın zamana kadar analiz edilmemiştir. Burada anlatılan ikinci teknik rea olduğunuSTRA6-katalizli retinol serbest veya yükleme l-zaman analizi. Üçüncü tekniği holo-RBP gelen hücresel retinol bağlayıcı protein I (CRBP-I) STRA6-katalizli retinol taşıma gerçek zamanlı analiz. Bu teknikler RBP reseptörün A vitamini alımı mekanizmayı açıklamada, yüksek hassasiyet ve çözünürlük sağlar.

Introduction

A vitamini, insan yaşam ve hemen hemen tüm insan organlarının düzgün işleyişi için gerekli olan organik bir moleküldür. A vitamini türevleri (retinoidler) vizyon 1,2 ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda 3-6 gen ekspresyonu ve protein çeviri düzenleme için ışık algılama dahil çeşitli biyokimyasal ve hücresel etkinliklere katılır. Retinol sistemik diffüz yeteneğine sahip olsa da, evrim plazma retinol bağlayıcı protein, vitamin yüksek verim ve spesifite elde etmek ve 7-10 rastgele difüzyon ile ilişkili toksisite önlemek için kan bir ulaşım için belirli bir taşıyıcı protein ile geldi. RBP bağlanır ve vitamin alır yüksek afiniteli reseptör A 1970'lerde 11-13 varsayılmıştır. RBP reseptör 14-31 varlığını üç yıl içinde biriken kanıtlara rağmen, reseptör hipotezine nedeniyle existenc yıllarca tartışıldıHolo-RBP yanlış bir tanım e. Sanal-RBP arasında doğru bir tanımı da retinol ve RBP arasında yüksek afinite 01:01 karmaşık olmasıdır. Organik çözücü tarafından sanal-RBP Mükerrer ekstraksiyon apo-RBP üretmek için gereklidir. Bu tanım, RBP 7,9,32-35 veya RBP reseptör 14-31,36-42 okuyan hemen hemen tüm laboratuarlar tarafından kullanılır. RBP reseptörünün varlığı çürütmek için kullanılan sanal-RBP arasında yanlış tanım apo-RBP ile serbest retinol akut karışımıdır. Vitamin RBP reseptör fonksiyonu yana holo-RBP A alımını holo-RBP gelen retinol yayınlayacak retinol (as holo ve yanlış tanımı tarafından önerilen ile başlayan ücretsiz ise, RBP reseptör retinol alımını hiçbir rol oynayacak -RBP).

Bir multitransmembrane etki protein olarak RBP reseptör son tanımlama STRA636 denilen ve vitamin işlevi holo-RBP 36-43 A alımını kuvvetle RBP değil hipotezi karşı savunuyorSTRA6 hücre içinde 40 bulunan bir transmembran 9 ekstraselüler yer alan N-terminus ile etki ve C-terminali sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır A vitamini detaylı analizler de teslim etmek için bir alıcı gereklidir. Transmembran 6 ve 7 arasında yer alan önemli bir RBP bağlayıcı alanı 39 olduğunu. STRA6 LRAT ve vitamin sanal-RBP A uptake CRBP-I hem de birleştirilmiştir, ancak LRAT, ne de CRBP-I tamamen gelişmiş bir etkinlik STRA6 41 için gereklidir. Olduğu Holo-RBP gelen retinol serbest katalize STRA6 yeteneği, onun A vitamini alımı etkinliği 41 için anahtardır. Onun retinol serbest STRA6 güvenerek, vitamin RBP A teslimat A vitamini yüksek özgüllük ve verimlilik ile periferik dokularda hücrelerin hedef taşıyabilir.

Holo-RBP tanımı ve hazırlanması büyük önem holo-RBP tanımları dif esas ilgili üç yeni makale ile de RBP reseptörünün varlığı tarihsel tartışmayı tarafından sadece gösterildiği, ancaközgün ve doğru tanımını 44-46 den ferent. İlk kağıt RBP reseptörü 44 okumak için RBP reseptörünün varlığı reddetmek için kullanılan sanal-RBP tanım kullanılır. İkinci ve üçüncü kağıtlar bile daha az retinol için çalışılması gereken RBP 45,46 ile uygun bir kompleks oluşturur yapılan sanal-RBP üçüncü bir tanımı ile geldi. Bu çalışmalar 3 H-retinol ile sanal-RBP (bile apo-RBP) karıştırılarak 3 H-retinol/RBP hazırlanmıştır. Bu testte 3 H-retinol/RBP oluşmuş ve aşırı ücretsiz 3 H-retinol 45,46 çıkarmadılar yoktu bu yana, 3 H-retinol/RBP 3 H-retinol alımı için bir test değil, ama ücretsiz bir 3 H-retinol difüzyon testi. Bu STRA6 LRAT 38 ya da CRBP-I 41 oranında serbest retinol hücre alımını artırmak olmadığı önceden gösterilmiştir. Hemen hemen tüm retinol kan içinde RBP bağlı olduğu ve hiçbir saptanabilir fre yokture retinol. RBP reseptör A ana işlevi holo-RBP 41'den retinol alımı sırasında holo-RBP gelen retinol serbest katalize etmektir. Retinol yapay olarak serbest ya da 45,46 ile başlamak için, serbest formdaki olduğu takdirde, RBP reseptör gerekli değildir. Doğru sanal-RBP RBP bu doğru hazırlanmasını göstermektedir hazırlanan esas testleri ile karşılaştırıldığında serbest retinol difüzyon testi elde ölçüde farklı sonuçlar fonksiyonel testler için çok önemlidir.

RBP insan serum den 41 arıtılmış, fakat bu işlem oldukça karmaşıktır ve düşük verim edilebilir. Alternatif bir yaklaşım, E. RBP üretmek için coli. Çünkü E. coli düzgün RBP gibi disülfid bağlarının birden fazla çift memeli salgılanan proteinler pas yeteneğine sahip değildir, katlanamayan RBP ve doğru katlanmış proteini saflaştırmak için gereklidir. Katlanan proteinleri sadece, farklı çeşitli testler giderilmiştir katlanmış RBP gelen davranmazfakat aynı zamanda saklama esnasında protein agregasyonu neden olur. Aynı nedenle, apo-RBP sadece yüksek kaliteli sanal-RBP üretilir. Biz kaliteli RBP bakteriyel ifade refolding ve HPLC arıtma yoluyla retinol ile yüklenen% 100 üretmek için burayı optimize edilmiş protokol açıklar. HPLC saflaştırma yanlış katlanmış RBP değil, aynı zamanda RBP sinyal transdüksiyon testlerin kullanılması durumunda ciddi eşya neden olabilir önemli bakteriyel kontaminasyon kaldırır sadece. Biz de STRA6 tarafından retinol ulaşım incelemek için iki hassas gerçek zamanlı izleme teknikleri anlatıyoruz. Her iki teknikler kaliteli RBP bağlıdır. Alanı sınırlamaları nedeniyle, radyoaktif retinoid tabanlı ve HPLC bazlı vitamin klasik teknikler alımını deneyleri burada yer verilmemiştir.

Protocol

1. Holo-RBP üretimi, refolding ve HPLC Arıtma PET3a vektör N-ucu üzerinde 6x His etiketi olan insan RBP için cDNA barındıran BL-21cells dönüştürülmesi. 600 nm'de OD kadar karbenisilin ile 40 mL LB ortamı içinde 37 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde transforme BL-21 hücrelerinin büyümesini 0,5 ulaşır. 1mM için IPTG ekleyerek RBP protein ekspresyonu øndükle. 37 bakteri büyümek ° C başka bir 5 saat. E.coli 'de üretilen RBP çözünmeyen inklüzyon c…

Representative Results

Biz sanal-RBP ve retinol yükleme apo-RBP içine (Şekil 2) ve gerçek zamanlı analiz itibaren STRA6-katalizli retinol serbest HPLC ile sanal-RBP üretimi ve saflaştırılması (Şekil 1), gerçek zamanlı analiz için buraya temsilcisi sonuçları sunmak Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I STRA6-katalizli retinol taşımacılığı (Şekil 3). Hemen hemen tamamen yanlış bir çok disülfid bağların varlığı nedeniyle katlanan bir refolding ol…

Discussion

RBP Üretim ve saflaştırma prosedürleri doğru katlanmış RBP üretme açısından kritik önem taşımaktadır çünkü biz burada bir optimize RBP üretim protokolü paylaşabilirsiniz. Katlanan RBP tür olasılığı ve RBP bakteri üretimi dahi HPLC saflaştırılmış içinde bakteriyel proteinler, eser miktarda varlığı göz önüne alındığında, RBP ile ilgili bir sonuç teyit etmek için serum dan doğal RBP kullanmak yararlıdır. Piyasada mevcut İdrar RBP, apo-RBP ve sanal-RBP 48,49 dahil …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sağlık hibe R01EY018144 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenir.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S., Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. . The Retinoids. 2, 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey’s small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O’Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Retinol TransportPlasma Retinol Binding ProteinHolo-RBPSTRA6Real-time AnalysisElectrophysiologyCRBP-IVitamin A Transport Mechanism
check_url/50169?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image