JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek om hoogwaardige vitamine A / RBP complex en twee real-time monitoring technieken om studeren vitamine A het vervoer door STRA6, de RBP-receptor te produceren.

Abstract

Vitamine A is essentieel voor het gezichtsvermogen en de groei / differentiatie van bijna alle menselijke organen. Plasma retinol-bindend eiwit (RBP) is het principe en specifieke drager van vitamine A in het bloed. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek te produceren en te zuiveren holo-RBP en twee real-time monitoring technieken om het vervoer van vitamine A door de hoge-affiniteit RBP receptor STRA6 bestuderen. De eerste techniek is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid hoge kwaliteit holo-RBP (100% geladen met retinol) voor vitamine A transport assays. Hoge kwaliteit RBP is essentieel voor functionele testen, omdat verkeerd gevouwen RBP releases vitamine A gemakkelijk en bacteriële besmetting in RBP voorbereiding kan leiden tot artefacten. Real-time monitoring technieken zoals elektrofysiologie zijn kritische bijdragen geleverd tot de studies van membraan transport. De RBP-receptor-gemedieerde retinol vervoer niet is geanalyseerd in real time tot voor kort. De tweede techniek is de hier beschreven real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol release of laden. De derde techniek is real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om cellulaire retinol-bindend eiwit I (CRBP-I). Deze technieken zorgen voor een hoge gevoeligheid en resolutie in het onthullen van RBP receptor vitamine A opname mechanisme.

Introduction

Vitamine A is een organisch molecuul dat essentieel is voor de menselijke overleving en de goede werking van bijna alle menselijke organen. Vitamine A-derivaten (retinoïden) deel te nemen aan diverse biochemische en cellulaire evenementen, waaronder de detectie van licht voor visie 1,2 en de regulatie van genexpressie en eiwit translatie tijdens de embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels 3-6. Hoewel retinol heeft de mogelijkheid om systemisch verspreiden, evolutie bedacht plasma retinol-bindend eiwit, een specifieke dragereiwit voor vitamine A transport in het bloed hoge efficiëntie en specificiteit te bereiken en toxiciteit van willekeurige diffusie 7-10 vermijden. Een hoge affiniteit receptor die bindt aan RBP en neemt vitamine A hypothese is in de jaren 1970 11-13. Ondanks bewijs verzameld in drie decennia op het bestaan ​​van de RBP receptor 14-31 werd de hypothese receptor besproken vele jaren door de existence van een onjuiste definitie van holo-RBP. De correcte definitie van holo-RBP is dat de hoge affiniteit 1:1 complex tussen retinol en RBP. Herhaalde extractie van holo-RBP organisch oplosmiddel moet apo-RBP produceren. Deze definitie wordt gebruikt door bijna alle laboratoria bestuderen RBP 7,9,32-35 of de RBP-receptor 14-31,36-42. De onjuiste bepaling van holo-RBP die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor weerleggen de acute mengsel van vrije retinol met apo-RBP. Aangezien de functie van de receptor RBP in vitamine A opname van holo-RBP is retinol bevrijden van holo-RBP de RBP receptor zou geen rol spelen in retinol opname als retinol vrij om te beginnen (zoals voorgesteld door de onjuiste bepaling van holo -RBP).

De recente identificatie van RBP receptor als multitransmembrane domein eiwit STRA636 en zijn functie in vitamine A opname van holo-RBP 36-43 sterk pleit tegen de hypothese dat niet RBPhebben een receptor aan vitamine A. Gedetailleerde analyse bleek dat STRA6 9 transmembraandomeinen de N-terminus extracellulair gelegen en C-terminus gelegen intracellulair 40 moet leveren. Gelegen tussen transmembraan 6 en 7 is een essentieel RBP bindend domein 39. STRA6 is gekoppeld aan zowel LRAT en CRBP-I in vitamine A opname van holo-RBP, maar noch LRAT noch CRBP-I is absoluut noodzakelijk voor een betere STRA6 activiteit 41. STRA6's vermogen om retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP is de sleutel tot de vitamine A-opname-activiteit 41. Door te vertrouwen op STRA6 zijn vrij retinol, vitamine A bezorging RBP transporteren vitamine A doelcellen in perifere weefsels met hoge specificiteit en efficiëntie.

De kritische belang van holo-RBP definitie en bereiding wordt geïllustreerd door niet alleen de historische discussie over het bestaan ​​van de RBP receptor, maar ook door drie verbonden recente artikelen op basis van holo-RBP definities diflende van het origineel en correcte definitie 44-46. De eerste papier de holo-RBP definitie die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor de receptor bestuderen RBP 44 afkeuren. De tweede en derde papers kwam met een derde definitie holo-RBP dat het nog minder waarschijnlijk retinol worden bestudeerd om een goede complex met RBP 45,46 vormen. Deze studies bereid door mengen van drie H-retinol/RBP holo-RBP (zelfs apo-RBP) met 3 H-retinol. Aangezien deze test niet hebben 3 H-retinol/RBP gevormd en verwijderde niet buitensporige vrije 3H-retinol 45,46 is geen test voor 3H-retinol opname van 3 H-retinol/RBP, maar is een vrije 3H-retinol diffusie assay. Eerder is aangetoond dat STRA6 geen cellulaire opname van vrije retinol verbeteren door LRAT 38 of CRBP-I 41. Vrijwel alle retinol is gebonden aan RBP in het bloed en er geen detecteerbare free retinol. Een van de belangrijkste functie van de RBP-receptor is retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP tijdens retinol opname van holo-RBP 41. Als de retinol kunstmatig model of in vrije vorm te beginnen 45,46 wordt het RBP receptor niet nodig. De sterk verschillende resultaten van de vrije diffusie retinol assay ten opzichte van assays gebaseerd op kunnen bereid holo-RBP illustreren dat correcte voorbehandeling van RBP is cruciaal voor de functionele assays.

RBP kan worden gezuiverd uit humaan serum 41, maar is complex en de opbrengst is laag. Een alternatieve benadering is om RBP produceren in E. coli. Omdat E. coli niet de mogelijkheid kunnen zoogdieren uitgescheiden eiwitten vouwen met meer dan een paar disulfidebindingen zoals RBP, is het essentieel om refold RBP en correct gevouwen eiwit te zuiveren. Verkeerd gevouwen eiwitten niet alleen gedragen zich anders uit gecorrigeerde gevouwen RBP in verschillende assays,maar ook tot eiwitaggregatie tijdens opslag. Om dezelfde reden wordt apo-RBP alleen geproduceerd uit hoogwaardig holo-RBP. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van hoge kwaliteit te produceren RBP 100% geladen met retinol door bacteriële expressie, hervouwing, en HPLC zuivering. HPLC zuivering verwijdert niet alleen verkeerd gevouwen RBP, maar ook belangrijke bacteriële besmetting die kan leiden tot ernstige artefacten als RBP wordt gebruikt in signaaltransductie assays. We beschrijven ook twee gevoelige real-time monitoring technieken om retinol vervoer bestuderen door STRA6. Beide technieken zijn afhankelijk van hoge kwaliteit RBP. Vanwege de beperkte ruimte, de klassieke technieken van radioactieve retinoïde-based en HPLC-gebaseerde vitamine A opname testen worden hier niet beschreven.

Protocol

1. Productie, hervouwing, en HPLC zuivering van Holo-RBP Transformeren BL-21cells de pET3a vector die het cDNA voor menselijke RBP met 6x His tag aan de N-terminus. Groeien de getransformeerde BL-21 cellen in een shaker bij 37 ° C in 40 ml LB medium met carbenicilline tot OD bij 600 nm bereikt 0.5. RBP eiwitexpressie induceren door toevoeging IPTG tot 1 mM. De bacteriën groeien bij 37 ° C nog eens 5 uur. RBP geproduceerd in E.coli is vooral aanwezig in onoplosbare inclusielichamen. Om in…

Representative Results

We stellen hier representatieve resultaten voor holo-RBP productie en zuivering door HPLC (figuur 1), real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol afgifte van holo-RBP en retinol lading in apo-RBP (Figuur 2) en real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om EGFP-CRBP-I (Figuur 3). Zonder hervouwing, RBP geproduceerd in bacteriën bijna volledig door de aanwezigheid van veel onjuiste disulfide bindingen ver…

Discussion

We delen hier een geoptimaliseerde RBP productieprotocol omdat RBP productie en zuivering procedures zijn cruciaal voor het genereren van correct gevouwen RBP. Gezien de mogelijkheid van verkeerd gevouwen RBP soorten en de aanwezigheid van sporen van bacteriële eiwitten zelfs HPLC gezuiverde bacteriën geproduceerde RBP, is het nuttig om natieve RBP gebruik van serum tot een conclusie met betrekking tot RBP bevestigen. Urine RBP, dat commercieel verkrijgbaar is, is een complex mengsel van vele soorten waaronder RBP apo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ondersteund door National Institutes of Health subsidie ​​R01EY018144.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S., Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. . The Retinoids. 2, 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey’s small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O’Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Retinol TransportPlasma Retinol Binding ProteinHolo-RBPSTRA6Real-time AnalysisElectrophysiologyCRBP-IVitamin A Transport Mechanism
check_url/50169?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image