Les analyses en temps réel des Transports rétinol par le récepteur membranaire de plasma Retinol Binding Protein

Summary

Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire de haute qualité complexe de la vitamine A / RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par STRA6, le récepteur de la RBP.

Abstract

La vitamine A est essentielle pour la vision et l'. Croissance / différenciation de presque tous les organes de l'homme Plasma retinol binding protein (RBP) est le principe et le transporteur spécifique de vitamine A dans le sang. Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire et purifier holo-RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par le récepteur de haute affinité RBP STRA6. La première technique permet de produire une grande quantité de haute qualité holo-RBP (100%-chargé avec rétinol) pour la vitamine A des dosages de transport. RBP haute qualité est essentielle pour les tests fonctionnels, car mal repliées RBP communiqués de vitamine A contamination bactérienne facilement et en préparation RBP peut causer des artefacts. Techniques de surveillance en temps réel, comme l'électrophysiologie ont apporté des contributions essentielles aux études de transport membranaire. La RBP médiée par le récepteur de transport du rétinol n'a pas été analysé en temps réel jusqu'à récemment. La seconde technique décrite ici est la raisonl analyse en temps STRA6 catalysée par la libération de rétinol ou le chargement. La troisième technique est analyse en temps réel de STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP au cellulaire retinol binding protein I (CRBP-I). Ces techniques offrent une sensibilité et une résolution élevées en révélant récepteur de la vitamine RBP Un mécanisme de captation.

Introduction

La vitamine A est une molécule organique qui est essentiel à la survie et au bon fonctionnement de presque tous les organes de l'homme. Dérivés de vitamine A (rétinoïdes) participer à divers événements biochimiques et cellulaires, y compris la détection de la lumière pour ^1,2 vision et la régulation de l'expression des gènes et la traduction des protéines au cours du développement embryonnaire et dans les tissus adultes ^3-6. Bien que le rétinol est capable de diffuser par voie systémique, l'évolution a proposé plasma protéine de liaison du rétinol, une protéine de support spécifique pour le transport de la vitamine A dans le sang d'atteindre une efficacité et une spécificité élevées et pour éviter la toxicité associée à la diffusion aléatoire ^7-10. Un récepteur de haute affinité qui se lie à RBP et prend de la vitamine A a été imaginé dans les années 1970, ^11-13. Malgré les preuves accumulées depuis trois décennies sur l'existence du récepteur RBP ^14-31, l'hypothèse du récepteur a été débattue pendant de nombreuses années en raison de l'existence d'une définition incorrecte des holo-RBP. La définition correcte des holo-RBP est que c'est la grande affinité complexe 1:1 entre le rétinol et la RBP. L'extraction répétée de holo-RBP par un solvant organique est nécessaire pour produire apo-RBP. Cette définition est utilisée par presque tous les laboratoires qui étudient RBP ^7,9,32-35 ou le récepteur RBP ^14-31,36-42. La définition incorrecte des holo-RBP qui a servi à réfuter l'existence du récepteur RBP est le mélange aiguë de libre rétinol-RBP avec apo. Puisque la fonction du récepteur de la vitamine A dans les RBP absorption de holo-RBP est de libérer le rétinol-RBP de holo, le récepteur RBP ne jouerait aucun rôle dans l'absorption du rétinol si rétinol est libre de commencer (comme proposé par la définition erronée du holo -RBP).

La récente identification du récepteur RBP comme un domaine protéique appelé multitransmembrane STRA636 et sa fonction dans l'absorption de la vitamine A à partir de holo-RBP ^36-43 milite fortement contre l'hypothèse que les pratiques commerciales restrictives nebesoin d'un récepteur pour fournir des analyses de vitamine A. détaillée a révélé que STRA6 9 domaines transmembranaires avec l'extrémité N-terminale extracellulaire situés et C-terminaux situés intracellulaire ^40. Situé entre transmembranaire 6 et 7 est un domaine essentiel RBP contraignant ^39. STRA6 est couplé à la fois LRAT et CRBP-je en vitamine A à partir de l'absorption holo-RBP, mais ni LRAT ni CRBP-I est absolument nécessaire pour une meilleure STRA6 activité ^41. STRA6 capacité à catalyser la libération de rétinol-RBP holo est la clé de son activité de vitamine A ⁴¹ l'absorption. En s'appuyant sur STRA6 pour libérer son rétinol, vitamine A par RBP peut transporter la vitamine A pour cibler les cellules dans les tissus périphériques avec une spécificité et une efficacité élevées.

L'importance cruciale de holo-RBP définition et la préparation est illustrée non seulement par le débat historique sur l'existence du récepteur RBP, mais aussi par trois associés travaux récents sur holo-RBP définitions difrents de la définition originale et correcte ^44-46. Le premier document utilisé la définition holo-RBP qui a été utilisé pour désapprouver l'existence du récepteur RBP pour étudier le récepteur RBP ^44. Les deuxième et troisième venu avec une troisième définition de holo-RBP qui rend encore moins probable que le rétinol à étudier pour former un complexe avec bon RBP ^45,46. Ces études préparées en mélangeant ³ H-retinol/RBP holo-RBP (même pas apo-RBP) avec ³ H-rétinol. Depuis ce test n'a pas ³ H-retinol/RBP formé et ne retirez pas excessive gratuitement ³ H-rétinol ^45,46, ce n'est pas un essai de ³ H-rétinol absorption de ³ H-retinol/RBP, mais est un logiciel gratuit ³ test de diffusion H-rétinol. Il a été montré précédemment que STRA6 ne favorise pas l'absorption cellulaire du rétinol libre par LRAT ³⁸ ou CRBP-I ^41. La quasi-totalité rétinol est lié à des pratiques commerciales restrictives dans le sang et il n'y a pas détectable fréquencee rétinol. Une fonction principale du récepteur RBP est de catalyser la libération de rétinol-RBP holo pendant la prise de rétinol-RBP holo ^41. Si le rétinol est artificiellement liberté provisoire ou sous forme libre pour commencer ^45,46, le récepteur RBP n'est pas nécessaire. Les résultats radicalement différents obtenus à partir du dosage du rétinol libre diffusion par rapport aux tests basés sur correctement préparés holo-RBP illustrer le fait que la préparation correcte de la RBP est crucial pour ses tests fonctionnels.

RBP peut être purifiée à partir de sérum humain ^41, mais la procédure est complexe et le rendement est faible. Une autre approche consiste à produire des RBP dans E. coli. Parce E. coli n'a pas la capacité de plier correctement mammifères protéines sécrétées avec plus d'une paire de liaisons disulfures comme RBP, il est essentiel de replier RBP et purifier la protéine correctement repliée. Protéines mal repliées non seulement se comportent différemment des RBP plié corrigé dans divers dosages,mais aussi provoquer l'agrégation des protéines au cours du stockage. Pour la même raison, l'apo-RBP est seulement produit de haute qualité holo-RBP. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour produire des RBP haute qualité 100% chargé avec le rétinol par l'expression bactérienne, repliement et purification par HPLC. Purification par HPLC élimine non seulement les pratiques commerciales restrictives mal repliées, mais aussi importante contamination bactérienne qui peut causer des artefacts graves si RBP est utilisé dans des essais de transduction du signal. Nous avons également décrire deux techniques sensibles de surveillance en temps réel pour étudier le transport du rétinol par STRA6. Les deux techniques dépendent de la RBP de haute qualité. Faute d'espace, les techniques classiques de la vitamine rétinoïde basée sur HPLC et basée sur des tests radioactifs A absorption ne sont pas décrites ici.

Protocol

1. Production, repliement et purification par HPLC de Holo-RBP Transformer BL-21cells avec le vecteur pET3a hébergeant l'ADNc humain pour RBP avec 6x His tag sur le N-terminal. Cultivez les transformées BL-21 cellules dans un shaker à 37 ° C dans 40 ml de milieu LB carbénicilline jusqu'à ce que la DO à 600 nm atteigne 0,5. Induire l'expression de la protéine RBP par addition d'IPTG 1 mM d'. Croître les bactéries à 37 ° C un autre 5 heures. RBP produite dans E. col…

Representative Results

Nous présentons les résultats ici représentatives des holo-RBP production et la purification par HPLC (figure 1), analyse en temps réel de STRA6 catalysée par la libération de rétinol-RBP holo et le chargement en rétinol-RBP apo (figure 2) et analyse en temps réel des STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP pour EGFP-CRBP-I (Figure 3). Sans repliement, RBP produit dans des bactéries est pratiquement complè…

Discussion

Nous partageons ici un protocole optimisé RBP RBP production en raison des procédures de production et de purification sont essentielles pour générer des RBP correctement repliée. Compte tenu de la possibilité que des espèces RBP mal repliées et la présence de quantités infimes de protéines bactériennes, même dans purifiée par HPLC bactéries produites RBP, il est utile d'utiliser des pratiques commerciales restrictives natif à partir du sérum pour confirmer une conclusion liée à des pratiques comm…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655