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Biology

血漿レチノール結合タンパク質の膜受容体によってレチノール交通のリアルタイム解析

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

ここでは、高品質のビタミン/ RBP複合体とSTRA6、RBP受容体によってビタミンAの輸送を研究するには、2つのリアルタイム·モニタリング技術を生成するように最適化手法を説明します。

Abstract

ビタミンAは視力とほぼすべての人間の器官の成長/分化に必須である。血漿レチノール結合タンパク質（RBP）は、原則とビタミン血液中の特定のキャリアである。ここで我々が​​生産し、高親和性受容体RBP STRA6によるビタミンの輸送を研究するためにホロRBPと2つのリアルタイム·モニタリング技術を浄化するための最適化手法について述べる。最初の方法は、それが可能な高品質のビタミンのためのホロRBP（100レチノール％ロード）輸送アッセイを大量に製造することができる。ミスフォールドRBPリリースビタミン容易にし、汚染細菌RBP準備ではアーチファクトを引き起こす可能性があるので、高品質のRBPは機能アッセイのために不可欠です。電気生理学のようなリアルタイムのモニタリング技術は膜輸送の研究に重要な貢献をしてきました。 RBP受容体媒介性のレチノール輸送はリアルタイムで最近まで分析されていません。ここで説明する2番目の方法はREAですSTRA6触媒によるレチノールリリースや負荷のl時間分析。第3の方法は、細胞のレチノール結合タンパク質I（CRBP-I）にホロRBPからSTRA6触媒によるレチノール輸送のリアルタイム分析である。これらの技術は、RBP受容体のビタミン取り込み機構を明らかにすることで、高感度と分解能を提供します。

Introduction

ビタミンAは、人類の生存と、ほとんどすべての人間の臓器を適切に機能させるために不可欠である有機分子である。ビタミンA誘導体（レチノイド）は視力1,2と胚の発生過程および成体組織3-6の遺伝子発現とタンパク質翻訳の調節のための光センシングなど多様な生化学的および細胞イベントに参加しています。レチノールは全身に拡散する能力を持っていますが、進化論は血漿レチノール結合蛋白質、ビタミン、高効率と特異性を達成し、7月10日ランダム拡散に関連する毒性を避けるために、血液中の輸送のための特定のキャリアタンパク質を思い付いた。 RBPに結合し、ビタミンを占める高親和性受容体は、1970 11月13日に仮定された。 RBP受容体14から31の存在に30年間で蓄積された証拠があるにもかかわらず、受容体仮説が原因existencに長年にわたり議論されたホロRBPの間違った定義のe。ホロRBPの正しい定義は、それがレチノールおよびRBPとの間に高い親和性1:1複合体であるということです。有機溶媒によるホロRBPの繰り返し抽出がアポRBPを生成する必要がある。この定義は、RBP 7,9,32-35またはRBP受容体14-31,36-42を勉強し 、ほぼすべてのラボで使用されます。 RBP受容体の存在を反証するために使用されたホロRBPの誤った定義がアポRBPとの自由レチノールの急性混合物である。ビタミンにおけるRBP受容体の機能ホロRBPから取り込みはホロRBPからレチノールを解放することであるので、レチノールが（ホロの間違った定義によって提案で始まって自由である場合には、RBP受容体はレチノール取り込みに何の役割も果たしていないでしょう-RBP）。

ホロRBPで36から43から取り込みが強く、RBPがないという仮説に対して主張している最近のSTRA636呼ばmultitransmembraneドメインタンパク質としてRBP受容体の同定とビタミンにおけるその機能STRA6は、N末端 ​​細胞外に位置しており、細胞内に位置する40 C-末端の9の膜貫通ドメインを有することが明らかになったビタミンAの詳細な分析を提供するために受容体を必要としています。貫 ​​通6と7の間に位置することが不可欠RBP結合ドメイン39です。 STRA6がLRATとビタミンでCRBP-IホロRBPから取り込みの両方に結合されたが、どちらもLRATさCRBP-Iは絶対に強化された41 STRA6活動のために必要です。ホロRBPからレチノールの放出を触媒するSTRA6の能力は、そのビタミン取り込み活性41への鍵となります。そのレチノールを解放するSTRA6に頼ることによって、ビタミンRBPによる配達は、ビタミン、高い特異性と効率性末梢組織中の細胞をターゲットに転送することができます。

ホロRBPの定義と準備が非常に重要であることは、RBP受容体の存在に関する歴史的論争ではなく、ホロRBP定義差に基づいて、3つの関連する最近の論文だけでなく示されているオリジナルと正しい定義44から46からferent。最初の論文は、RBP受容体44を勉強するRBP受容体の存在を不承認とするために使用されたホロRBPの定義を使用していました。 2番目と3番目の論文は、RBP 45,46との適切な複合体を形成するために検討すべきことがあっても可能性が低いレチノールのために作らホロRBPの3番目の定義を思い付いた。これらの研究は、3 H-レチノールとホロRBPを（なくてもアポRBP）混合することにより、3 H-retinol/RBPを用意しました。このアッセイは3 H-retinol/RBPが形成され、過度の自由、3 H-レチノール45,46を削除しなかった持っていなかったので、3 H-retinol/RBPから3 H-レチノール取り込みのためのアッセイではありませんが、無料です3 H-レチノール拡散アッセイ。それはSTRA6がLRAT 38またはCRBP-Iの41でフリーレチノールの細胞への取り込みを増強しないことが以前に示されている。事実上すべてのレチノールは、血液中のRBPに結合され、検出可能な周波数がありません電子レチノール。 RBP受容体の主な機能は、ホロRBP 41からレチノール取り込み時にホロRBPからレチノール放出を触媒することがあります。レチノールが人為的に放出または45,46で始まるように遊離体であるされている場合は、RBP受容体は必要ありません。正しくホロRBPはRBPの正しい調製を例示する準備に基づくアッセイに比べて自由なレチノール拡散アッセイから得られた劇的に異なった結果は、その機能アッセイするために重要です。

RBPは、ヒト血清41から精製され、手順が複雑であり、収率が低いことができます。別のアプローチは、EにRBPを生成することです大腸菌。ため、E.大腸菌が正しくRBPようなジスルフィド結合の複数のペアで哺乳類の分泌タンパク質をフォールドする能力を持っていない、それがフォールディングRBP、正しく折り畳まれたタンパク質を精製するために不可欠です。ミスフォールドタンパク質は、様々なアッセイに折り畳まれたRBPを訂正とは異なる動作をするだけでなく、だけでなく、貯蔵中のタンパク質凝集を引き起こす。同じ理由で、アポRBPは、高品質のホロRBPから生産されています。我々はここで細菌発現、フォールディング、及びHPLC精製を通じてレチノールでロード高品質RBP 100％を生成する最適化されたプロトコルを記述します。 HPLC精製は、誤って折り畳まれたRBPはなく、RBPはシグナル伝達アッセイで使用されている場合、重大なアーチファクトを引き起こす可能性があります重要な細菌汚染を除去するだけでなく。またSTRA6によってレチノール輸送を研究するには、2つの敏感なリアルタイム監視手法について説明します。両方の技術は、高品質のRBPによって異なります。スペースの制限のため、放射性レチノイドベースおよびHPLCベースのビタミンの古典的な技法は取り込みアッセイは、ここでは説明しません。

Protocol

1。ホロRBPの生産、リフォールディングし、HPLC精製 pET3aベクトルがN末端に6×Hisタグを有するヒトRBPのcDNAを保有するとともに、BL-21cellsを変換します。 600 nmでのODまでカルベニシリンと40mlのLB培地で37℃で振とう機における形質転換BL-21細胞を成長させるには0.5に達する。 1mMとなるようにIPTGを添加し、RBPタンパク質の発現を誘導する。 37℃で細菌を培養℃でさらに5時間。 大?…

Representative Results

我々は、HPLC（ 図1）、アポRBP（ 図2）とのリアルタイム分析にホロRBP及びレチノールのローディングからSTRA6触媒によるレチノールリリースをリアルタイムで分析することによりここにホロRBPの生産および精製の ​​ための代表的な結果を提示ホロRBPからEGFP-CRBP-IへSTRA6触媒によるレチノール輸送（ 図3）。 リフォールディングするこ…

Discussion

RBPの生産および精製手順が正しく折り畳まれたRBPを生成するために重要ですので、我々はここで最適化されたRBP生産プロトコルを共有しています。ミスフォールドRBP種の可能性、さらにはHPLC精製細菌生産RBP内細菌タンパク質の微量の存在を考えると、それは、RBPに関連した結論を確認するために血清からネイティブRBPを使用すると便利です。市販されている尿中RBPは、アポRBPとホロRBP 48…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

健康助成R01EY018144の国立研究所によってサポートされています。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
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References

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Retinol TransportPlasma Retinol Binding ProteinHolo-RBPSTRA6Real-time AnalysisElectrophysiologyCRBP-IVitamin A Transport Mechanism
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Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
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