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Biology

प्लाज्मा Retinol बाइंडिंग प्रोटीन की झिल्ली रिसेप्टर द्वारा वास्तविक समय Retinol परिवहन का विश्लेषण

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

यहाँ हम एक अनुकूलित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले विटामिन ए / RBP जटिल और दो वास्तविक समय की निगरानी करने के लिए विटामिन STRA6, RBP रिसेप्टर परिवहन अध्ययन तकनीक उत्पादन तकनीक का वर्णन करता है.

Abstract

विटामिन ए दृष्टि के लिए आवश्यक है और लगभग सभी मानव अंगों के विकास / भेदभाव. प्लाज्मा retinol बाध्यकारी प्रोटीन (RBP) और रक्त में विटामिन की विशिष्ट वाहक सिद्धांत है. यहाँ हम एक अनुकूलित उत्पादन और holo RBP और दो वास्तविक समय की निगरानी तकनीकों शुद्ध करने के लिए उच्च आत्मीयता RBP STRA6 रिसेप्टर द्वारा विटामिन ए की परिवहन अध्ययन तकनीक का वर्णन करता है. पहली तकनीक के उच्च गुणवत्ता के लिए विटामिन (retinol के साथ 100% लोड) holo-RBP परिवहन assays की एक बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए यह संभव बनाता है. उच्च गुणवत्ता RBP कार्यात्मक assays के लिए आवश्यक है क्योंकि RBP विज्ञप्ति विटामिन misfolded RBP तैयारी में आसानी से और बैक्टीरियल संदूषण कलाकृतियों को पैदा कर सकता है. वास्तविक समय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तरह निगरानी तकनीक झिल्ली परिवहन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है. RBP रिसेप्टर की मध्यस्थता retinol परिवहन हाल ही में जब तक वास्तविक समय में नहीं किया गया विश्लेषण किया गया है. 2 यहाँ वर्णित तकनीक वजह विनिर्माण कर रहे हैSTRA6 उत्प्रेरित retinol रिहाई या लोड के एल समय विश्लेषण. 3 तकनीक STRA6 उत्प्रेरित retinol holo-RBP से सेलुलर retinol बाध्यकारी प्रोटीन मैं (CRBP-I) के लिए परिवहन की वास्तविक समय विश्लेषण है. इन तकनीकों में उच्च और खुलासा RBP रिसेप्टर विटामिन ए तेज तंत्र में संवेदनशीलता संकल्प प्रदान करते हैं.

Introduction

विटामिन ए एक कार्बनिक अणु है कि मानव अस्तित्व और लगभग सभी मानव अंगों के समुचित कार्य के लिए आवश्यक है. विटामिन ए डेरिवेटिव (retinoids) दृष्टि 1,2 और भ्रूण विकास के दौरान और वयस्क 3-6 ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति और प्रोटीन अनुवाद के विनियमन के लिए प्रकाश की संवेदन सहित विविध जैव रासायनिक और सेलुलर घटनाओं में भाग लेते हैं. हालांकि retinol प्रणालीबद्ध फैलाना की क्षमता है, विकास प्लाज्मा retinol बाध्यकारी प्रोटीन, उच्च दक्षता और विशिष्टता प्राप्त करने और यादृच्छिक 7-10 प्रसार के साथ जुड़े विषाक्तता से बचने के लिए रक्त में एक परिवहन विटामिन के लिए एक विशिष्ट वाहक प्रोटीन के साथ आया था. एक उच्च आत्मीयता रिसेप्टर है कि RBP बांधता है और विटामिन लेता 11-13 1970 के दशक में धारणा थी. RBP 14-31 रिसेप्टर के अस्तित्व पर तीन दशकों में संचित सबूत होने के बावजूद, रिसेप्टर परिकल्पना के कारण कई वर्षों के लिए existenc बहस हुई थीholo RBP की एक गलत परिभाषा के ई. holo RBP की सही परिभाषा यह है कि यह retinol और RBP के बीच उच्च आत्मीयता 01:01 जटिल है. कार्बनिक विलायक holo RBP की दोहराया निष्कर्षण APO RBP उत्पादन के लिए आवश्यक है. इस परिभाषा के लगभग सभी RBP 7,9,32-35 या RBP 14-31,36-42 रिसेप्टर का अध्ययन प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाता है. holo RBP की गलत परिभाषा है कि RBP रिसेप्टर के अस्तित्व खंडन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था APO – RBP साथ मुक्त retinol के तीव्र मिश्रण है. विटामिन में RBP रिसेप्टर के समारोह के बाद से holo RBP से एक तेज holo RBP से retinol जारी है, RBP रिसेप्टर retinol तेज में कोई भूमिका नहीं निभा अगर retinol मुक्त है के साथ शुरू करने (holo की गलत परिभाषा के द्वारा प्रस्तावित )-RBP.

RBP रिसेप्टर एक multitransmembrane डोमेन प्रोटीन के रूप में पहचान की हाल ही STRA636 बुलाया और विटामिन में अपनी समारोह holo-RBP 36-43 से एक तेज दृढ़ता परिकल्पना है कि नहीं करता है RBP के खिलाफ तर्कएक रिसेप्टर के लिए विटामिन ए विस्तृत विश्लेषण करती है पता चला कि STRA6 9 transmembrane डोमेन एन टर्मिनस के साथ extracellularly स्थित और सी टर्मिनस 40 intracellularly स्थित है देने की जरूरत है. Transmembrane 6 और 7 के बीच स्थित एक आवश्यक RBP बाध्यकारी 39 डोमेन है. STRA6 दोनों LRAT और CRBP मैं holo RBP से एक तेज विटामिन में युग्मित है, लेकिन न तो LRAT न ही CRBP मैं बिल्कुल बढ़ाया 41 STRA6 गतिविधि के लिए आवश्यक है. है STRA6 holo RBP से retinol रिहाई को उत्प्रेरित करने की क्षमता अपने विटामिन ए तेज 41 गतिविधि करने के लिए महत्वपूर्ण है. STRA6 पर भरोसा करने के लिए अपने retinol जारी करके, विटामिन RBP द्वारा एक वितरण करने के लिए एक उच्च विशिष्टता और दक्षता के साथ परिधि के ऊतकों में कोशिकाओं को लक्षित विटामिन परिवहन कर सकते हैं.

holo RBP परिभाषा और तैयारी के महत्व को न केवल RBP रिसेप्टर के अस्तित्व पर ऐतिहासिक बहस के द्वारा सचित्र है, लेकिन यह भी तीन संबंधित हाल ही में holo RBP परिभाषाओं अलग आधार पर कागजातमूल और सही परिभाषा 44-46 से अलग है. पहले कागज holo-RBP परिभाषा कि RBP RBP रिसेप्टर 44 अध्ययन रिसेप्टर के अस्तित्व को अस्वीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. दूसरे और तीसरे कागजात holo-RBP की एक तिहाई परिभाषा है कि यह retinol के लिए कम होने की संभावना भी अध्ययन किया जा 45,46 RBP साथ उचित जटिल फार्म के साथ आया था. इन अध्ययनों 3 एच retinol holo RBP (भी नहीं APO RBP) के मिश्रण से 3 H-retinol/RBP तैयार. चूंकि इस परख नहीं था 3 H-retinol/RBP का गठन किया था और अत्यधिक मुक्त 3 45,46 एच retinol को दूर नहीं है, यह एक परख से 3 H-retinol/RBP 3 एच retinol तेज के लिए, नहीं है लेकिन एक स्वतंत्र है 3 एच retinol प्रसार परख. यह पहले से दिखाया गया है कि STRA6 LRAT 38 या 41 CRBP मैं मुक्त retinol के सेलुलर तेज वृद्धि नहीं करता है. वस्तुतः सभी retinol के रक्त में RBP ही है और वहाँ कोई detectable fre हैई retinol. RBP रिसेप्टर के एक मुख्य समारोह holo RBP से holo – RBP 41 से retinol तेज दौरान retinol रिहाई को उत्प्रेरित करने के लिए है. यदि retinol या कृत्रिम रूप से जारी की है और मुक्त रूप में 45,46 के साथ शुरू करते हैं, RBP रिसेप्टर की जरूरत नहीं है. नाटकीय रूप से अलग से प्राप्त मुक्त retinol प्रसार परख के रूप में सही ढंग से तैयार holo-RBP RBP की है कि सही तैयारी वर्णन पर आधारित assays के लिए तुलना परिणाम इसके कार्यात्मक assays के लिए महत्वपूर्ण है.

RBP मानव सीरम 41 से शुद्ध किया जा सकता है, लेकिन प्रक्रिया जटिल है और उपज कम है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण ई. में RBP उत्पादन कोलाई क्योंकि ई. कोलाई RBP तरह डाइसल्फ़ाइड बांड की एक से अधिक जोड़ी के साथ सही ढंग से स्तनधारी secreted प्रोटीन गुना करने की क्षमता नहीं है, यह refold RBP और सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आवश्यक है. Misfolded प्रोटीन सही विभिन्न assays में जोड़ RBP से अलग ही व्यवहार नहीं है,लेकिन यह भी भंडारण के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण कारण. उसी कारण से, APO RBP केवल उच्च गुणवत्ता holo RBP से निर्मित है. हम यहाँ एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता RBP 100% बैक्टीरियल अभिव्यक्ति, refolding और HPLC शोधन के माध्यम से retinol के साथ भरी हुई हैं. HPLC शोधन न केवल गलत तरीके से मुड़ा हुआ है, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण जीवाणु संक्रमण है कि गंभीर कलाकृतियों कारण अगर RBP संकेत पारगमन assays में प्रयोग किया जाता है RBP हटा. हम भी दो संवेदनशील वास्तविक समय की निगरानी लिए STRA6 द्वारा retinol परिवहन अध्ययन तकनीक का वर्णन. दोनों तकनीकों उच्च गुणवत्ता RBP पर निर्भर करते हैं. अंतरिक्ष सीमाओं के कारण, रेडियोधर्मी retinoid आधारित और HPLC आधारित विटामिन की क्लासिक तकनीक एक तेज assays यहाँ नहीं वर्णित हैं.

Protocol

1. उत्पादन, refolding, और Holo – RBP की HPLC शोधन BL-21cells pET3a वेक्टर एन टर्मिनस पर 6x उनके टैग के साथ मानव RBP लिए सीडीएनए को शरण देने के साथ रूपांतरण. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में तब्दील BL 21-कोशिकाओं कार्बेनिसिलि?…

Representative Results

हम HPLC द्वारा holo RBP – उत्पादन और शोधन (1 चित्रा), STRA6 उत्प्रेरित holo-RBP और retinol loading APO – RBP में (2 चित्रा) और वास्तविक समय विश्लेषण के से retinol रिलीज के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए यहाँ के प्रतिनिधि के परिणाम पे?…

Discussion

हम यहाँ एक अनुकूलित RBP उत्पादन प्रोटोकॉल का हिस्सा है क्योंकि RBP उत्पादन और शोधन की प्रक्रिया सही ढंग से मुड़ा RBP पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Misfolded RBP प्रजातियों और बैक्टीरियल प्रोटीन भी HPLC विशुद्ध में RB…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01EY018144 के संस्थान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
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References

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Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
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