Real-time analyser av Retinol Transport av membranen Receptor av Plasma Retinol Binding Protein

Summary

Her beskriver vi en optimalisert teknikk for å produsere høy kvalitet vitamin A / RBP kompleks og to sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere vitamin A transport av STRA6, den RBP reseptoren.

Abstract

Vitamin A er essensielt for visjonen og vekst / differensiering av nesten alle menneskelige organer. Plasma retinol bindende protein (RBP) er prinsippet og bestemt transportør av vitamin A i blodet. Her beskriver vi en optimalisert teknikk for å produsere og rense holo-RBP og to sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere transport av vitamin A ved høy affinitet RBP reseptor STRA6. Den første teknikken gjør det mulig å produsere en stor mengde av høykvalitets holo-RBP (100%-lastet med retinol) for vitamin A transport-analyser. Høy kvalitet RBP er avgjørende for funksjonelle analyser fordi misfolded RBP utgivelser vitamin A lett og bakteriell forurensning i RBP forberedelse kan forårsake artefakter. Sanntidsovervåking teknikker som elektrofysiologi har gjort kritiske bidrag til studier av membran transport. Den RBP reseptor-mediert retinol transport har ikke blitt analysert i sanntid inntil nylig. Den andre teknikken beskrevet her er real-time analyse av STRA6-katalysert retinol utgivelse eller lasting. Den tredje teknikk er real-time analyse av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til mobilnettet retinol bindende protein I (CRBP-I). Disse teknikkene gir høy følsomhet og oppløsning i avslørende RBP reseptor er vitamin A opptak mekanisme.

Introduction

Vitamin A er en organisk molekyl som er avgjørende for menneskers overlevelse og riktig funksjon av nesten alle menneskelige organer. Vitamin A derivater (retinoider) deltar i ulike biokjemiske og cellulære hendelser inkludert sensing av lys for syn ^1,2 og regulering av genuttrykk og protein oversettelse under embryonal utvikling og hos voksne vev ^3-6. Selv retinol har evnen til å diffundere systemisk, kom evolusjon opp med plasma retinol bindende protein, en spesifikk bærerprotein for vitamin A transport i blodet for å oppnå høy effektivitet og spesifisitet og unngå toksisitet forbundet med tilfeldig diffusjon ^7-10. En høy affinitet reseptor som binder seg til RBP og tar opp vitamin A ble antatt i 1970 ^11-13. Tross for bevis akkumulert i tre tiår på eksistensen av RBP reseptor ^14-31, ble reseptoren hypotesen debattert i mange år på grunn av den existence av feil definisjon av holo-RBP. Den korrekte definisjonen av holo-RBP er at det er den høye affinitet 01:01 kompleks mellom retinol og RBP. Gjentatt ekstraksjon av holo-RBP av organisk oppløsningsmiddel er nødvendig for å produsere apo-RBP. Denne definisjonen brukes av nesten alle laboratorier studerer RBP ^7,9,32-35 eller RBP reseptoren ^14-31,36-42. Den ukorrekte definisjonen av holo-RBP som ble brukt til å avkrefte eksistensen av RBP reseptoren er den akutte blanding av fri retinol med apo-RBP. Siden funksjonen til RBP reseptor i vitamin A opptak fra holo-RBP er å frigjøre retinol fra holo-RBP, ville RBP reseptoren spiller ingen rolle i retinol opptak hvis retinol er fritt til å begynne med (som foreslått av feil definisjonen av holo -RBP).

Den nylige identifikasjonen av RBP reseptor som multitransmembrane domene protein kalt STRA636 og dens funksjon i vitamin A opptak fra Holo-RBP ^36-43 sterkt argumenterer mot hypotesen om at RBP ikketrenger en reseptor for å levere vitamin A. Detaljerte analyser avslørte at STRA6 har 9 transmembrane domener med N-terminus plassert ekstracellulært og C-terminus lokalisert intracellulært ^40. Ligger mellom transmembran 6 og 7 er en essensiell RBP bindende domene ^39. STRA6 er koblet til både LRAT og CRBP-I i vitamin A opptak fra Holo-RBP, men verken LRAT eller CRBP-I er absolutt nødvendig for bedre STRA6 aktivitet ^41. STRA6 evne til å katalysere retinol utgivelse fra holo-RBP er nøkkelen til sitt vitamin A opptak aktivitet ^41. Ved å stole på STRA6 å slippe sin retinol, vitamin A levering av RBP transportere vitamin A til målceller i perifere vev med høy spesifisitet og effektivitet.

Den kritiske viktigheten av holo-RBP definisjon og forberedelse er illustrert ikke bare av historisk debatt om eksistensen av RBP reseptoren, men også av tre beslektede siste papirene basert på holo-RBP definisjoner difskjellige fra den opprinnelige og riktige definisjonen ^44-46. Den første papiret brukte holo-RBP definisjon som ble brukt til å godkjenne eksistensen av RBP reseptoren å studere RBP reseptoren ^44. Den andre og tredje papirer kom opp med en tredje definisjon av holo-RBP som gjorde det enda mindre sannsynlig for retinol å bli undersøkt for å danne en skikkelig kompleks med RBP ^45,46. Disse studiene fremstilles ³ H-retinol/RBP ved blanding holo-RBP (ikke engang apo-RBP) med ³ H-retinol. Siden denne analysen ikke har ³ H-retinol/RBP dannet og ikke fjerne overdreven frie ³ H-retinol ^45,46, er det ikke en assay for ^3H-retinol opptak fra ³ H-retinol/RBP, men er en fri ³ H-retinol diffusjon analysen. Det har blitt vist tidligere at STRA6 ikke forbedre cellulært opptak av fritt retinol etter LRAT ³⁸ eller CRBP-I ^41. Nesten all retinol er bundet til RBP i blodet, og det er ingen påviselig free retinol. En hovedfunksjon RBP reseptoren er å katalysere retinol utgivelse fra Holo-RBP under retinol opptak fra Holo-RBP ^41. Dersom retinol er kunstig frigis eller er i fri form til å begynne med ^45,46, er RBP reseptoren ikke nødvendig. De dramatisk forskjellige resultater innhentet fra gratis retinol diffusjon analysen i forhold til analyser basert på riktig forberedt holo-RBP illustrere at riktig tilberedning av RBP er avgjørende for sine funksjonelle analyser.

RBP kan bli renset fra humant serum ^41, men prosedyren er kompleks og utbyttet er lavt. En alternativ tilnærming er å produsere RBP i E. coli. Fordi E. coli har ikke evnen til å fullstendig folde pattedyr utskilte proteiner med mer enn ett par av disulfidbindinger som RBP, er det viktig å refold RBP og rense fullstendig foldet protein. Misfolded proteiner ikke bare oppfører seg annerledes enn korrigert brettet RBP i ulike analyser,men også forårsake proteinaggregering under lagring. Av samme grunn er apo-RBP bare produsert av høy kvalitet holo-RBP. Vi beskriver her en optimalisert protokoll for å produsere høy kvalitet RBP 100% lastet med retinol gjennom bakteriell uttrykk, refolding, og HPLC rensing. HPLC-rensing ikke bare fjerner feil foldet RBP men også betydelig bakteriell forurensning som kan forårsake alvorlige gjenstander hvis RBP brukes i signaltransduksjon analyser. Vi beskriver også to sensitive sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere retinol transport av STRA6. Begge teknikkene avhenge av høy kvalitet RBP. På grunn av plassbegrensninger, de klassiske teknikker for radioaktivt retinoid-baserte og HPLC-baserte vitamin A opptak analysene ikke er beskrevet her.

Protocol

1. Produksjon, refolding, og HPLC rensing av Holo-RBP Transform BL-21cells med pET3a vektor harboring cDNA for menneskelig RBP med 6x Hans koden på N-terminus. Dyrke transformerte BL-21 celler i en risteapparat ved 37 ° C i 40 ml LB-medium med Carbenicillin inntil OD ved 600 nm når 0,5. Indusere RBP protein uttrykk ved å legge IPTG til 1mm. Dyrke bakterier ved 37 ° C ytterligere 5 hr. RBP produsert i E.coli er mest til stede i uløselige inkludering organer. Å berike inkludering organ…

Representative Results

Vi presenterer her representative resultater for Holo-RBP produksjon og rensing av HPLC (figur 1), real-time analyse av STRA6-katalysert retinol utgivelse fra Holo-RBP og retinol lasting i apo-RBP (figur 2) og real-time analyse av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til EGFP-CRBP-I (figur 3). Uten refolding, produsert RBP i bakterier er nesten helt misfolded grunnet tilstedeværelsen av mange uriktige disulfidbindinger. Derfor, r…

Discussion

Vi deler her en optimalisert RBP produksjon protokoll fordi RBP produksjon og rensing prosedyrer er avgjørende for å generere riktig brettet RBP. Gitt muligheten for misfolded RBP arter og tilstedeværelsen av spormengder av bakterielle proteiner selv i HPLC renset bakterier produserte RBP, er det nyttig å bruke innfødt RBP fra serum å bekrefte en konklusjon relatert til RBP. Urin RBP, som er kommersielt tilgjengelig, er en kompleks blanding av mange arter av RBP inkludert apo-RBP og holo-RBP ^48,49.

…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655