Realtid Analyser av Retinol Transport från membranreceptor av plasma Retinol Binding Protein

Summary

Här beskriver vi en optimerad teknik för att producera högkvalitativa vitamin A / RBP komplex och två realtid tekniker övervakning att studera vitamin A transport med STRA6, RBP-receptorn.

Abstract

Vitamin A är viktigt för vision och tillväxt / differentiering av nästan alla mänskliga organ. Plasma retinol-bindande protein (RBP) är principen och specifika bärare av vitamin A i blodet. Här beskriver vi en optimerad teknik för att producera och rena holo-RBP och två realtid tekniker övervakning för att studera transport av vitamin A som med hög affinitet RBP receptorn STRA6. Den första tekniken gör det möjligt att framställa en stor mängd av hög kvalitet holo-RBP (100% laddad med retinol) för vitamin A transport-analyser. Hög kvalitet RBP är viktigt för funktionella analyser eftersom felveckade RBP släpper vitamin A lätt och bakteriell förorening RBP förberedelse kan orsaka artefakter. Realtidsövervakning tekniker som elektrofysiologi har gjort avgörande bidrag till studier av membrantransport. RBP-receptormedierad retinol transporter har inte analyserats i realtid tills nyligen. Den andra tekniken som beskrivs här är reaL-time analys av STRA6-katalyserad retinol version eller lastning. Den tredje tekniken är realtidsanalys av STRA6-katalyserad retinol transport från holo-RBP till cellulär retinol bindande protein I (CRBP-I). Dessa tekniker ger hög känslighet och upplösning i avslöjande RBP receptorns vitamin A upptag mekanism.

Introduction

Vitamin A är en organisk molekyl som är nödvändigt för människors överlevnad och en väl fungerande nästan alla mänskliga organ. Vitamin A-derivat (retinoider) delta i olika biokemiska och cellulära händelser inklusive avkänning av ljus för vision ^1,2 och reglering av genuttryck och protein översättning under embryonal utveckling och hos vuxna vävnader ^3-6. Även retinol har förmågan att diffundera systemiskt, kom evolution upp med plasma retinol-bindande protein, ett specifikt bärarprotein för vitamin A transport i blodet för att uppnå hög effektivitet och specificitet och för att undvika toxicitet associerad med slumpmässig spridning ^7-10. En receptor med hög affinitet som binder till RBP och tar upp vitamin A hypotes i 1970 ^11-13. Trots bevis samlats i tre decennier på förekomsten av RBP-receptorn ^14-31, var receptorn hypotesen debatterats i många år på grund av existence av en felaktig definition av holo-RBP. Den korrekta definitionen av holo-RBP är att det är hög affinitet 1:1 komplex mellan retinol och RBP. Upprepad extraktion av holo-RBP av organiskt lösningsmedel är nödvändig för att producera Apo-RBP. Denna definition används av nästan alla laboratorier studerar RBP ^7,9,32-35 eller RBP-receptorn ^14-31,36-42. Den felaktiga definitionen av holo-RBP som användes för att motbevisa existensen av RBP-receptorn är den akuta blandningen av fri retinol med apo-RBP. Eftersom funktionen hos RBP-receptorn på vitamin A upptag från holo-RBP är att frigöra retinol från holo-RBP skulle RBP-receptorn spelar någon roll i retinol upptag om retinol är fri att börja med (som föreslås i felaktig definition av holo -RBP).

Den senaste identifieringen av RBP-receptorn som multitransmembrane domän protein som kallas STRA636 och dess funktion på vitamin A upptag från holo-RBP ^36-43 starkt argumenterar mot hypotesen att RBP intebehöver en receptor för att leverera vitamin A. Detaljerade analyser avslöjade att STRA6 har 9 transmembrandomäner med N-terminalen belägna extracellulärt och C-terminala belägna intracellulärt ^40. Ligger mellan transmembran 6 och 7 är en väsentlig RBP bindande domän ^39. STRA6 är kopplad till både LRAT och CRBP-I i vitamin A upptag från holo-RBP, men varken LRAT eller CRBP-I är absolut nödvändig för ökad STRA6 aktivitet ^41. STRA6 förmåga att katalysera retinol frisättning från holo-RBP är nyckeln till dess vitamin upptag aktivitet ^41. Genom att förlita sig på STRA6 att släppa sin retinol kan vitamin A leverans av RBP transportera vitamin A till målceller i perifera vävnader med hög specificitet och effektivitet.

Den avgörande betydelsen av holo-RBP definition och förberedelser illustreras inte bara av historiska debatten om förekomsten av RBP-receptorn, men också av tre relaterade senaste artiklar baserade på holo-RBP definitioner DIFkanal än den ursprungliga och korrekt definition ^44-46. Den första papper som används holo-RBP definition som användes för att underkänna förekomsten av RBP-receptorn för att studera RBP-receptorn ^44. Den andra och tredje papper kom med tredjedel definition av holo-RBP som gjorde det ännu mindre troligt att retinol studeras för att bilda en riktig komplex med RBP ^45,46. Dessa studier framställdes ³ H-retinol/RBP genom blandning holo-RBP (inte ens apo-RBP) med ³ H-retinol. Eftersom denna analys inte hade ³ H-retinol/RBP bildades och tog inte bort överdriven gratis ³ H-retinol ^45,46, är det inte en analys för ³ H-retinol upptag från ³ H-retinol/RBP, men är en fri ³ H-retinol diffusionsanalys. Det har tidigare visats att STRA6 inte ökar cellulärt upptag av fri retinol från LRAT ³⁸ eller CRBP-I ^41. Praktiskt taget alla retinol är bunden till RBP i blodet och det finns ingen detekterbar frekvense retinol. En viktig funktion hos RBP-receptorn är att katalysera retinol befrielse från holo-RBP under retinol upptag från holo-RBP ^41. Om retinol artificiellt frigörs eller är i fri form till att börja med ^45,46, är RBP receptorn inte behövs. De dramatiskt olika resultat från den fria retinol diffusionsanalys jämfört med analyser baserade på korrekt beredd holo-RBP visar att korrekt beredning av RBP är avgörande för dess funktionella analyser.

RBP kan renas från humant serum ^41, men proceduren är komplicerad och utbytet är lågt. Ett alternativt tillvägagångssätt är att producera RBP i E. coli. Eftersom E. E. coli har inte förmågan att korrekt vika däggdjur utsöndrade proteiner med mer än ett par av disulfidbindningar som RBP, är det viktigt att återveckning RBP och rena korrekt vikta proteinet. Felveckade proteiner inte bara beter sig annorlunda från korrigerade vikt RBP i olika analyser,utan också orsaka proteinaggregering under lagring. Av samma anledning är apo-RBP endast tillverkas av högkvalitativt holo-RBP. Vi beskriver här en optimerad protokoll för att producera högkvalitativa RBP 100% laddad med retinol genom bakteriell uttryck, återveckning och HPLC-rening. HPLC-rening inte bara tar bort fel vikta RBP utan också betydande bakteriell kontamination som kan orsaka allvarliga artefakter om RBP används i analyser signaltransduktion. Vi beskriver också två känsliga realtidsövervakning tekniker för att studera retinol transporter med STRA6. Båda teknikerna är beroende av hög kvalitet RBP. På grund av platsbrist, A upptag analyser de klassiska teknikerna för radioaktivt retinoid-baserade och HPLC-baserade vitamin inte beskrivs här.

Protocol

1. Produktion, Återveckning och HPLC-rening av Holo-RBP Transform BL-21cells med pET3a vektorn härbärgerar den cDNA för humant RBP med 6x His-markör på N-terminalen. Odla transformerade BL-21-celler i en skakapparat vid 37 ° C i 40 medium ml LB med karbenicillin tills OD vid 600 nm når 0,5. Inducerar RBP proteinuttryck genom att lägga IPTG till 1 mM. Odla bakterierna vid 37 ° C ytterligare 5 timmar. RBP producerat i E. coli finns mestadels närvarande i olösliga inklusionskroppar…

Representative Results

Vi presenterar här representativa resultat för holo-RBP produktion och rening med HPLC (figur 1), i realtid analys av STRA6-katalyserad retinol frisättning från holo-RBP och retinol lastning i apo-RBP (figur 2) och realtid analys av STRA6-katalyserad retinol transport från holo-RBP till EGFP-CRBP-I (Figur 3). Utan återveckning, producerade RBP i bakterier är nästan helt felvikt grund av närvaron av många felaktiga disulfidbindninga…

Discussion

Vi delar här en optimerad protokoll RBP produktion eftersom RBP produktion och rening förfaranden är avgörande för att skapa korrekt vikt RBP. Med tanke på risken för felveckade RBP arter och förekomsten av spårmängder av bakteriella proteiner även i HPLC-renade bakterier producerade RBP är det bra att använda inhemska RBP från serum för att bekräfta en slutsats relaterad till RBP. Urin RBP, som är kommersiellt tillgänglig, är en komplex blandning av många arter av RBP inklusive apo-RBP och holo-RBP …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655