प्राथमिक Preneoplastic स्तन उपकला कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग स्तन कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से निकाली
Summary
समय चूक इमेजिंग प्राथमिक preneoplastic स्तन उपकला अनुवांशिक इंजीनियर स्तन कैंसर के खतरे के माउस मॉडल से प्राप्त करने के लिए निर्धारित करती है कि वहाँ विशिष्ट व्यवहार मापदंडों और अलग आनुवंशिक घावों के बीच सहसंबंध कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
समय चूक इमेजिंग सुसंस्कृत प्राथमिक preneoplastic स्तन उपकला अलग अनुवांशिक इंजीनियर स्तन कैंसर के माउस मॉडल से ली गई कोशिकाओं के व्यवहार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, सेल (सेल जन्मों) डिवीजनों, apoptotic सेल नंबर, morphological परिवर्तन के विकास, और कॉलोनी के गठन की व्यवस्था के बीच समय और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है विशिष्ट आनुवंशिक घावों ले कोशिकाओं की तुलना में. प्राथमिक स्तन उपकला कोशिका संस्कृतियों स्पर्शनीय ट्यूमर बिना स्तन ग्रंथियों से उत्पन्न कर रहे हैं. ग्रंथियों ध्यान बगल पेशी से स्पष्ट जुदाई के साथ resected हैं, लिम्फ नोड्स को हटा रहे हैं और समृद्ध स्तन उपकला कोशिकाओं की एकल कोशिका निलंबन enzymatic पृथक्करण और निस्पंदन द्वारा पीछा नख़रेबाज़ स्तन ऊतकों द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. एकल कक्ष निलंबन चढ़ाया और जीवित कोशिका इमेजिंग के लिए एक मशीन कक्ष के भीतर एक खुर्दबीन के नीचे सीधे रखा. सोलह 650 सुक्ष्ममापी x 700 प्रत्येक w से एक 4×4 विन्यास में सुक्ष्ममापी क्षेत्रों6-अच्छी तरह से एक थाली के पक्ष 5 दिनों के लिए हर 15 मिनट imaged. समय चूक छवियों सीधे सेलुलर व्यवहार है कि कोशिकाओं चढ़ाना के पहले 24 घंटे (एकत्रीकरण बनाम सेल प्रसार), apoptosis की घटनाओं, और morphological परिवर्तन के चरणबद्ध के भीतर और सेल कॉलोनी के गठन की व्यवस्था आवृत्ति शामिल कर सकते हैं को मापने के लिए जांच कर रहे हैं. एकल सेल ट्रैकिंग सेल व्यक्तिगत सेल जन्मों और कोशिका विभाजन पैटर्न की जांच के माप के लिए भाग्य नक्शे उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मात्रात्मक डेटा सांख्यिकीय व्यवहार में महत्वपूर्ण मतभेद विशिष्ट आनुवंशिक घावों के साथ सहसंबद्ध के लिए आकलन का विश्लेषण कर रहे हैं.
Introduction
अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल का अध्ययन करने और समझने के लिए कैसे अलग आनुवंशिक घावों स्तन कैंसर के विकसित होने के जोखिम के लिए योगदान करने के लिए उपकरण हैं. उदाहरण के लिए, अनुवांशिक इंजीनियर चूहों से पता चला है कि तीन कारकों का संयोजन: पूर्ण लंबाई स्तन कैंसर 1, (बीआरसीए 1) जल्दी शुरुआत स्तन उपकला कोशिकाओं में जीन ट्यूमर प्रोटीन (TP53) p53 अगुणित अपर्याप्तता रोगाणु लाइन, और स्तन उपकला की हानि सेल लक्षित विनियमित एस्ट्रोजेन रिसेप्टर अल्फा (युग) बीआरसीए 1 (च) 11/f11/Mouse स्तन ट्यूमर (MMTV) वायरस -Cre/p53 + / (-/tetracycline-operator floxed की 100% में स्तन कैंसर के विकास में एक्सप्रेशन परिणाम tet सेशन) -ER/MMTV-reverse टेट्रासाइक्लिन transactivator (rtTA कम f11/f11/MMTV-Cre/p53 बीआरसीए 1 में रिपोर्ट प्रतिशत + / की तुलना में उम्र के 12 महीनों के द्वारा चूहों के बिना युग चूहों पर अभिव्यक्ति (50 ~ 60)% और बीआरसीए 1 TP53 haploinsuf बिना f11/f11/MMTV-Cre चूहोंficiency (<5%) 1.
Preneoplastic प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के व्यवहार के गतिशील समय चूक इमेजिंग सेल व्यवहार में मतभेद है कि आसानी से कम स्थिर ऊतक वर्गों में की सराहना कर रहे हैं पता चलता है. प्रसार और भेदभाव में बदलाव मानव बीआरसीए 1 उत्परिवर्तन वाहक से प्राथमिक स्तन कोशिकाओं में मनाया जाता है और सामान्य से प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं के एकल कोशिका निलंबन और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के 2 निर्माण resected स्तन ग्रंथि के ऊतकों के enzymatic disassociation के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं. 3 समय चूक छवियों के लिए तंत्र और सेल कॉलोनी उपस्थिति और उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) और apoptosis सहित कोशिकाओं में morphological परिवर्तन की घटनाओं के समय का आकलन करने के लिए देखा जाता है. सेल भाग्य नक्शे का सृजन, कोशिका (सेल जन्मों) डिवीजनों, और कोशिका विभाजन के पैटर्न के दृढ़ संकल्प के बीच समय की लंबाई की मात्रा का ठहराव एकल कोशिका ट्रैकिंग के उपयोग के द्वारा की है. Timm'ट्रैकिंग उपकरण (TTT) publically उपलब्ध सॉफ्टवेयर एकल कोशिका भाग्य नक्शे को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया है. सेल भाग्य के तंत्र elucidating में इसकी उपयोगिता 4,5 स्थापित किया गया है सामान्य hematopoietic स्टेम सेल 6-9 विकास और न्यूरॉन्स की पीढ़ी की जांच 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
महत्वपूर्ण कदम
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि स्तन ग्रंथियों स्तन उपकला कोशिका व्यवहार में उम्र से संबंधित परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के लिए एक ही उम्र के चूहों से काटा जाता ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को अपने परिचय के लिए तकनीकी सहायता और माइकल Rieger के लिए Bofan वू और ईसाई Raithel जीना सेल इमेजिंग के लिए शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. NCI, एनआईएच RO1CA112176 (पीएएफ), NCI, एनआईएच द्वारा समर्थित है. (पीएएफ) R01CA89041-10S1, Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 रेफरी. 316 (ren), रक्षा विभाग W81XWH-11-1-0,074 (ren), पीएएफ WCU कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से शिक्षा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (R31 10,069) द्वारा वित्त पोषित प्रोग्राम (वर्ल्ड क्लास यूनिवर्सिटी) ( ), IG20 RR025828 01 (कृंतक बैरियर सुविधा उपकरण),, एनआईएच, और NIH NCI 5P30CA051008 (माइक्रोस्कोपी और साझा इमेजिंग और पशु संसाधन).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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