Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama
Summary
Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.
Abstract
Imagen de lapso de tiempo se puede usar para comparar el comportamiento de cultivos primarios de células epiteliales mamarias preneoplásicas derivados de los diferentes modelos de ratón genéticamente modificadas de cáncer de mama. Por ejemplo, el tiempo entre las divisiones celulares (móviles vidas), números de células apoptóticas, la evolución de los cambios morfológicos, y el mecanismo de formación de colonias pueden ser cuantificados y comparados en las células que transportan determinadas lesiones genéticas. Cultivos primarios de células epiteliales mamarias se generan a partir de glándulas mamarias sin tumor palpable. Glándulas son cuidadosamente resecado con clara separación de músculo adyacente, se extraen ganglios linfáticos, y solo suspensiones de células enriquecidas de células epiteliales mamarias se generan por el tejido mamario de picar carne seguido por disociación enzimática y filtración. Solo suspensiones de células se colocan en placas y se coloca directamente bajo un microscopio en una cámara incubadora para vivo de células de imágenes. Dieciséis 650 micras x 700 micras campos en una configuración 4×4 de cada well de una placa de 6-así se crean imágenes cada 15 minutos durante 5 días. Lapso de tiempo imágenes son examinados directamente para medir los comportamientos celulares que pueden incluir mecanismo y frecuencia de formación de colonia de células dentro de las primeras 24 horas de placas las células (agregación frente a la proliferación celular), la incidencia de la apoptosis, y la eliminación gradual de los cambios morfológicos. Una sola célula de seguimiento se utiliza para generar mapas de destino celular para la medición de tiempos de vida de células individuales y la investigación de los patrones de división celular. Los datos cuantitativos se analizaron estadísticamente para evaluar las diferencias significativas en el comportamiento correlacionado con determinadas lesiones genéticas.
Introduction
Genéticamente modificados modelos de ratón son herramientas para estudiar y entender cómo diferentes lesiones genéticas que contribuyen al riesgo de desarrollar cáncer de mama. Por ejemplo, los ratones transgénicos han demostrado que la combinación de tres factores: la pérdida de la mama de longitud completa cáncer 1, inicio temprano (BRCA1) de genes en células epiteliales mamarias, la proteína p53 tumor (TP53) de la línea germinal haploinsuficiencia, y epiteliales mamarias célula diana hasta reguladas estrógeno receptor alfa (EEI) los resultados de expresión en el desarrollo del cáncer de mama en el 100% de los genes BRCA1 floxed (f) Virus 11/f11/Mouse tumor mamario (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transactivador (rtTA ratones a los 12 meses de edad en comparación con los porcentajes más bajos reportados en Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – ratones sin ERa sobre-expresión (~ 50 – 60%) y BRCA1 ratones f11/f11/MMTV-Cre sin Tp53 haploinsufdeficiencia (<5%). 1
Dinámica de lapso de tiempo de imagen del comportamiento de preneoplásicas células epiteliales primarias mamarias revela diferencias en el comportamiento de las células que son menos fácilmente apreciadas en secciones de tejido estáticas. Las alteraciones en la proliferación y la diferenciación se observan en células primarias mamarias de humanos portadores de mutaciones BRCA1. 2 Creación de una sola célula suspensiones de células primarias epiteliales mamarias normales y de ratones transgénicos se generan a través de la disociación enzimática de tejido extirpado la glándula mamaria. 3 Time-lapse imágenes se ven a evaluar mecanismo y el momento de aparición de células colonia y la incidencia de los cambios morfológicos en las células, incluyendo epitelio-mesenquimal transición (EMT) y la apoptosis. Generación de mapas de destino celular, la cuantificación de la longitud de tiempo entre las divisiones celulares (tiempos de vida de células), y la determinación de los patrones de división celular se facilita por el uso de una sola célula de seguimiento. TimmHerramienta de Seguimiento 's (TTT) es un software a disposición del público para generar una sola célula de mapas de destino. Su utilidad en la elucidación de mecanismos de destino de la célula se ha establecido 4,5 examinar el desarrollo normal de células madre hematopoyéticas 6-9 y la generación de neuronas. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos
Es importante asegurarse de que las glándulas mamarias se cosechan a partir de ratones de la misma edad de controlar por edad relacionados con la variabilidad en el comportamiento de células epiteliales mamarias. Cuando en placas las células, el mismo número de células se deben sembraron en cada pocillo para cada experimento. Las células deben ser relativamente escasa cuando enchapado, de modo que las culturas no se hacen confluentes demasiado rápido por lo que es pos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Bofan Wu y Raithel cristiana de asistencia técnica y Michael Rieger para su introducción a imágenes de células vivas. Apoyado por el NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN) del Departamento de Defensa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (R31-10069) (PAF ), NIH RR025828 GI20-01 (barrera contra roedores equipos de la instalación) y NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopía e Imagen y Recursos Compartidos Animal).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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