Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer
Summary
Time-lapse bildebehandling brukes til å vurdere oppførselen primære preneoplastic mammary epitelceller avledet fra genmanipulerte mus modeller av risikoen for brystkreft for å avgjøre om det er sammenhenger mellom spesifikke atferdsmessige parametere og distinkte genetiske lesjoner.
Abstract
Time-lapse imaging kan brukes til å sammenligne oppførselen dyrkede primære preneoplastic mammary epitelceller utledet fra forskjellige genmanipulerte musemodeller av brystkreft. For eksempel kan tiden mellom celledelinger (celle levetid), apoptotiske celler tall, utviklingen av morfologiske endringer, og mekanismen av kolonien formasjon kvantifiseres og sammenlignes i celler som bærer spesifikke genetiske forandringer. Primære mammary epitel cellekulturer blir generert fra brystkjertlene uten håndgripelig svulst. Kjertler er nøye resected med klart skille fra tilstøtende muskel, blir lymfeknutene fjernet, og encellede suspensjoner av beriket mammary epitelceller genereres av hakking mammary vev etterfulgt av enzymatisk dissosiasjon og filtrering. Encellede suspensjoner er belagt og plassert direkte under et mikroskop innenfor en inkubator kammer for live-cell imaging. Seksten 650 mikrometer x 700 mikrometer felt i en 4×4-konfigurasjon fra hver well av en 6-brønns plate er avbildes hvert 15 min i 5 dager. Time-lapse bilder er undersøkt direkte å måle mobilnettet atferd som kan inkludere mekanisme og hyppigheten av celle koloni formasjon innenfor de første 24 hr av plating cellene (aggregering versus celledeling), forekomst av apoptose, og innfasing av morfologiske endringer. Encellede sporing brukes til å generere celle skjebne kart for måling av individuelle celle levetid og etterforskning av celledeling mønstre. Kvantitative data er statistisk analysert for å vurdere for betydelige forskjeller i oppførsel korrelert med spesifikke genetiske lesjoner.
Introduction
Genmanipulerte mus modeller er verktøy for å studere og forstå hvordan ulike genetiske lesjoner bidrar til risikoen for å utvikle brystkreft. For eksempel har genmanipulerte mus vist at kombinasjonen av tre faktorer: tap av full-lengde bryst 1 kreft, tidlig debut (BRCA1) genet i mammary epitelceller, tumor protein p53 (TP53) bakterie-linje haploinsufficiency og mammary epitelial celle målrettet opp-regulert Østrogen reseptor alfa (ERA) uttrykk resultater i utviklingen av mammary kreft i 100% av BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyklin transactivator (rtTA mus ved 12 måneders alder i forhold til de lavere prosenter rapportert i BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – mus uten ERA over-uttrykk (~ 50 – 60%) og BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre mus uten TP53 haploinsufficiency (<5%). 1
Dynamisk time-lapse avbildning av oppførselen preneoplastic primære mammary epitelceller avslører forskjeller i celle atferd som er mindre lett verdsatt i statiske vevsdelene. Endringer i spredning og differensiering er observert i primære mammary celler fra menneskelige BRCA1 mutasjon bærere. 2 Opprettelse av encellede suspensjoner av primære mammary epitelceller fra normal og genmanipulerte mus genereres gjennom enzymatisk disassociation av resected melkekjertlene. 3 Time-lapse Bildene er vist å vurdere mekanisme og timing av celle koloni utseende og forekomst av morfologiske endringer i celler, inkludert epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og apoptose. Generering av celle skjebne kartene blir kvantifisering av lengden av tiden mellom celledelinger (celle levetid), og bestemmelse av mønstre av celledeling tilrettelagt av bruk av encellede sporing. Timm'S Sporing Tool (TTT) er offentlig tilgjengelig programvare som brukes til å generere encellede skjebne kart. Sin nytteverdi i belyse mekanismer celle skjebne er etablert 4,5 undersøke normale hematopoetisk stamcelle utvikling 6-9 og generering av nerveceller. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn
Det er viktig å sikre at brystkjertlene høstes fra mus av samme alder å kontrollere for aldersrelatert variasjon i mammary epitelcelleopprinnelse atferd. Når plating cellene, bør samme antall celler bli belagt i hver brønn for hver eksperiment. Celler bør være relativt sparsom når plating slik at kulturer ikke blir sammenflytende altfor raskt gjør det mulig å følge flere individuelle celler gjennom serielle bilder. Det er viktig at platen være ekvilibrert i kuvøse f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Bofan Wu og Christian Raithel for teknisk bistand og Michael Rieger for sin innledning til live-cell imaging. Støttet av NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Facility Equipment), og NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi og Imaging and Animal delte ressurser).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
