Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft
Summary
Time-lapse billeddannelse til at vurdere adfærd primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra genetisk manipulerede musemodeller af risikoen for brystkræft for at bestemme, om der er sammenhænge mellem bestemte adfærdsmæssige parametre og forskellige genetiske læsioner.
Abstract
Time-lapse billeddannelse kan anvendes til at sammenligne adfærden af dyrkede primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra forskellige genetisk manipulerede musemodeller for brystkræft. For eksempel kan tidsrummet mellem celledelinger (celle levetid), apoptotiske celleantal, udviklingen af morfologiske ændringer, og mekanismerne for kolonidannelse kvantificeres og sammenlignes med celler, der bærer specifikke genetiske læsioner. Primære brystepitelceller cellekulturer genereres fra mælkekirtlerne uden palpable tumor. Kirtler er nøje resekteres med klar adskillelse fra tilstødende muskel, er lymfeknuder fjernet, og enkelt-cellesuspensioner af berigede mammae epitelceller genereres af hakning brystvæv efterfulgt af enzymatisk dissociation og filtrering. Enkelt-cellesuspensioner udplades og anbringes direkte under et mikroskop i en inkubator kammer til live-cell imaging. Seksten 650 um x 700 um felter i en 4×4 konfiguration fra hver well af en 6-brønds plade afbildes hvert 15. minut i 5 dage. Time-lapse billeder undersøges direkte at måle cellulære adfærd, der kan omfatte mekanismen og hyppigheden af celle-kolonidannelse under de første 24 timer af udpladning af cellerne (sammenlægning versus celleproliferation), forekomst af apoptose, og udfasning af morfologiske ændringer. Encellede sporing anvendes til at generere celle skæbne kort til måling af enkelte celle levetid og undersøgelse af celledeling mønstre. Kvantitative data er statistisk analyseret for at vurdere for store forskelle i adfærd korreleret med specifikke genetiske læsioner.
Introduction
Gensplejsede musemodeller er værktøjer til at undersøge og forstå, hvordan forskellige genetiske læsioner bidrager til risikoen for at udvikle brystkræft. For eksempel har genetisk modificerede mus vist, at kombinationen af tre faktorer: tab af fuldlængde brystkræft 1, tidlig begyndelse (BRCA1) gen i mammale epitelceller, tumor protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency, og brystepitelceller celle målrettet opreguleret østrogen receptor alpha (ERA) ekspression resulterer i udviklingen af brystcancer i 100% af BRCA1 floxet (f) 11/f11/Mouse brysttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyclin transaktivator (rtTA mus ved 12 måneders alderen i forhold til de lavere procentsatser rapporteret i BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – mus uden ERA overekspression (~ 50 – 60%) og BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre mus uden TP53 haploinsuftet (<5%). en
Dynamisk time-lapse billeder af adfærd præneoplastiske primære brystepitelceller celler afslører forskelle i celle adfærd, der er mindre let værdsat i statiske vævssnit. Ændringer i proliferation og differentiering er observeret i primære mammae celler fra menneskelige BRCA1 mutation luftfartsselskaber. 2 Oprettelse af enkelt-cellesuspensioner af primære brystepitelceller celler fra normal og gensplejsede mus genereres gennem enzymatisk disassociation af resekterede mælkekirtelvævet. 3 Time-lapse billeder er set at vurdere mekanisme og timingen af celle-koloni udseende og forekomsten af morfologiske ændringer i celler, herunder epitel-mesenchymale overgang (EMT) og apoptose. Generering af celle skæbne kort, er kvantificering af længden af tid mellem celledelinger (celle levetid), og bestemmelse af mønstre af celledeling lettes ved anvendelse af encellede tracking. Timm'S Tracking Tool (TTT) er offentligt tilgængelig software, der bruges til at generere encellede skæbne kort. Dens anvendelighed til belysning mekanismer celle skæbne er etableret 4,5 undersøge normale hæmatopoietiske stamceller udvikling 6-9 og dannelse af neuroner. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin
Det er vigtigt at sikre, at mælkekirtlerne høstes fra mus på samme alder at kontrollere for aldersrelateret variabilitet i brystkirtler epitelcelle adfærd. Når udpladning af cellerne, burde det samme antal celler udpladet i hver brønd i hvert eksperiment. Celler bør være relativt sparsom ved udpladning således at kulturerne ikke bliver sammenflydende for hurtigt gør det muligt at følge flere individuelle celler gennem serielle billeder. Det er afgørende, at pladen ækv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Bofan Wu og Christian Raithel til teknisk bistand og Michael Rieger for hans introduktion til live-cell imaging. Understøttet af NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) program gennem National Research Foundation of Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (R31-10.069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Facility Equipment), og NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi og Imaging og Animal Shared Resources).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
