Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker
Summary
Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.
Abstract
Time-lapse imaging kunnen worden gebruikt om het gedrag van gekweekte primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen uit verschillende genetisch gemanipuleerde muizen modellen van borstkanker te vergelijken. Zo kan tijd tussen celdelingen (cel levensduur), apoptotische aantal cellen, evolutie van morfologische veranderingen, en het mechanisme van kolonievorming worden gekwantificeerd en vergeleken cellen die specifieke genetische lesies. Primaire borstklier epitheliale celculturen worden gegenereerd uit melkklieren, zonder voelbare tumor. Klieren zijn zorgvuldig gereseceerd met duidelijke scheiding van aangrenzende spieren, worden lymfeklieren verwijderd, en single-cell suspensies van verrijkte borstklier epitheliale cellen worden gegenereerd door hakken borstweefsel gevolgd door enzymatische dissociatie en filtratie. Eencellige suspensies worden uitgeplaat en direct onder een microscoop in een incubator kamer voor levende cellen imaging. Zestien 650 um x 700 urn velden in een 4×4-configuratie van elk well van een 6-well plaat belicht worden elke 15 minuten gedurende 5 dagen. Time-lapse beelden worden onderzocht rechtstreeks cellulaire gedrag dat mechanisme en de frequentie van kolonievorming cellen kunnen bestaan binnen de eerste 24 uur van het uitplaten van de cellen (aggregatie versus celproliferatie), incidentie van apoptose en fasering van morfologische veranderingen te meten. Single-cell tracking wordt gebruikt om lot van de cel kaarten voor het meten van individuele cel levens en het onderzoek van de celdeling patronen te genereren. Kwantitatieve gegevens worden statistisch geanalyseerd voor de evaluatie significante verschillen in gedrag gecorreleerd met specifieke genetische lesies.
Introduction
Genetisch gemanipuleerde muismodellen zijn instrumenten te bestuderen en te begrijpen hoe verschillende genetische afwijkingen bijdragen aan het risico op het ontwikkelen van borstkanker. Bijvoorbeeld genetisch gemanipuleerde muizen aangetoond dat de combinatie van drie factoren: verlies van de volledige lengte borstkanker 1, early onset (BRCA1) gen in mammaire epitheelcellen, p53 tumor (TP53) germinale haploinsufficiëntie en mammaire epitheliale cel gerichte upgereguleerd oestrogeen receptor alpha (ERa) expressie resulteert in de ontwikkeling van borstkanker in 100% van BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse borsttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracycline transactivator (rtTA muizen met 12 maanden in vergelijking met de lagere percentages gerapporteerd in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / – muizen zonder ERa over-expressie (~ 50 – 60%) en BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre muizen zonder TP53 haploinsufficiëntie (<5%) 1.
Dynamic time-lapse beeldvorming van het gedrag van preneoplastische primaire mammaire epitheelcellen toont verschillen in celgedrag die minder gemakkelijk gewaardeerd statische weefselcoupes. Veranderingen in proliferatie en differentiatie worden waargenomen in primaire borstklieren cellen van menselijke BRCA1 mutatie dragers. 2 Oprichting van single-cell suspensies van primaire borstklier epitheliale cellen van normale en genetisch gemanipuleerde muizen worden gegenereerd door middel van enzymatische dissociatie van operatief verwijderde borstklierweefsel. 3 Time-lapse beelden worden bekeken op mechanisme en de timing van cel kolonie uiterlijk en de incidentie van morfologische veranderingen in cellen met inbegrip van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) en apoptose te beoordelen. Genereren van lot van de cel kaarten, zijn kwantificering van de lengte van de tijd tussen celdelingen (cel levens), en de bepaling van de modellen van de celdeling vergemakkelijkt door het gebruik van single-cell tracking. TimmTracking Tool 's (TTT) is publiekelijk beschikbare software wordt gebruikt om single-lot van de cel kaarten te genereren. Het nut in ophelderen mechanismen van cel lot is vastgesteld 4,5 onderzoeken normale hematopoietische stamcellen ontwikkeling 6-9 en het genereren van neuronen 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen
Het is belangrijk dat melkklieren worden geoogst uit muizen van dezelfde leeftijd te controleren voor leeftijdsgerelateerde variabiliteit in mammaire epitheelcellen gedrag. Bij uitplaten van de cellen, moet hetzelfde aantal cellen worden uitgeplaat in elk putje voor elk experiment. Cellen moeten relatief dun als plateren zodat culturen worden niet confluent te snel waardoor het mogelijk meerdere individuele cellen volgen door seriële beelden. Het is essentieel dat de plaat in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Bofan Wu en christelijke Raithel bedanken voor technische bijstand en Michael Rieger voor zijn kennismaking met live-cell imaging. Ondersteund door NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Ministerie van Defensie W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma via de National Research Foundation van Korea gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Knaagdieren Barrier Facility Equipment) en NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopie en Imaging en Animal Gedeelde bronnen).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
