Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet
Summary
Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.
Abstract
Zeitraffer-Aufnahmen verwendet werden, um das Verhalten von kultivierten primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus verschiedenen gentechnisch veränderten Mausmodellen von Brustkrebs ableiten zu vergleichen. Zum Beispiel kann zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), apoptotischen Zellzahlen, Evolution von morphologischen Veränderungen, und der Mechanismus der Koloniebildung quantifiziert und verglichen werden Zellen, die spezifische genetische Läsionen. Primäre Brustepithelzellen Zellkulturen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor erzeugt. Drüsen sorgfältig mit klare Trennung von angrenzenden Muskels reseziert werden Lymphknoten entfernt, und Einzelzellsuspensionen von angereichertem Brustepithelzellen werden durch Zerkleinern Brustgewebe durch enzymatische Dissoziation und anschließender Filtration erzeugt. Single-Zellsuspensionen ausplattiert und direkt unter dem Mikroskop platziert innerhalb einer Inkubatorkammer für Live-Cell-Imaging. Sixteen 650 um x 700 um Felder in einer 4×4-Konfiguration von jedem well einer 6-Well-Platte werden alle 15 min 5 Tage lang abgebildet. Zeitraffer-Bilder untersucht direkt an zellulären Mechanismus Verhaltensweisen, und die Häufigkeit der Zellkolonie Bildung innerhalb der ersten 24 Stunden der Ausplattieren der Zellen (Aggregation gegenüber Zellproliferation), Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen gehören zu messen. Single-cell-Tracking wird verwendet, um das Schicksal der Zelle Karten für die Messung der einzelnen Zelle Lebensdauer und Untersuchung der Zellteilung Muster zu erzeugen. Quantitative Daten werden statistisch ausgewertet, um auf signifikante Unterschiede im Verhalten mit spezifischen genetischen Läsionen korreliert beurteilen.
Introduction
Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind Werkzeuge, um zu studieren und zu verstehen, wie verschiedene genetische Läsionen das Risiko an Brustkrebs zu erkranken beitragen. Beispielsweise wurden gentechnisch Mäusen gezeigt, dass die Kombination von drei Faktoren ab: Verlust des Volllängen-Brustkrebs 1, früher Ausbruch (BRCA1) Gens in Brustepithelzellen, Tumor Protein p53 (TP53) Keimbahn Haploinsuffizienz und Brustepithelzellen Zelle gezielt hochreguliert Östrogenrezeptor alpha (ERa) Expression zur Entwicklung von Brustkrebs in 100% der BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( Tet-op) -ER/MMTV-reverse Tetracyclin-Transaktivator (rtTA Mäusen durch Alter von 12 Monaten im Vergleich zu den niedrigeren Prozentsätzen in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 berichteten + / – Mäuse ohne ERa Überexpression (~ 50 – 60%) und BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre Mäuse ohne TP53 haploinsufenz (<5%). 1
Dynamische Zeitraffer-Bildgebung des Verhaltens von präneoplastischen primäre Brustepithelzellen zeigt Unterschiede in Zellverhalten, die weniger leicht in statischen Gewebeschnitte sind erwünscht. Änderungen in der Proliferation und Differenzierung in der primären Mamma-Zellen aus menschlichen BRCA1-Mutation Träger beobachtet. 2 Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen von primären Brustepithelzellen von normalen und gentechnisch veränderten Mäusen durch enzymatische Dissoziation von resezierten Brustdrüsengewebe generiert werden. 3 Zeitraffer Bilder betrachtet werden, um den Mechanismus und den Zeitpunkt der Zellkolonie Aussehen und Auftreten von morphologischen Veränderungen in Zellen, einschließlich epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und Apoptose zu beurteilen. Erzeugung Zellschicksals Karten werden Quantifizierung der Länge der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), und Bestimmung von Mustern der Zellteilung durch Verwendung von Single-Cell-Tracking erleichtert. Timm'S Tracking Tool (TTT) ist öffentlich verfügbaren Software verwendet, um einzelne Zellen Schicksal Karten zu erzeugen. Ihre Nutzbarkeit in der Aufklärung der Mechanismen Zellschicksals wurde festgestellt 4,5 Prüfung normalen hämatopoetischen Stammzelle Entwicklung 6-9 und die Erzeugung von Neuronen. 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte
Es ist wichtig sicherzustellen, dass Brustdrüsen von Mäusen des gleichen Alters für altersbedingte Variabilität Brustepithelzellen Zellverhalten steuern geerntet. Wenn Ausplattieren der Zellen, sollte die gleiche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung zu jedem Experiment plattiert werden. Zellen sollten relativ spärlichen beim Plattieren, so dass Kulturen nicht zu schnell konfluieren die es ermöglichen, mehrere einzelne Zellen durch serielle Bilder folgen. Es ist wichtig,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Bofan Wu und Christian Raithel für technische Hilfe und Michael Rieger herzlich für seine Einführung in die Live-Cell-Imaging. Unterstützt durch NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) Programm durch die National Research Foundation of Korea durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (R31-10069) finanziert (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Einrichtung Equipment) und NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopie und Imaging and Animal Freigegebene Ressourcen).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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