التنمية، والتوسع، و<em> في الجسم الحي</em> رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)
Summary
يصف هذا البروتوكول على تطوير وتوسيع والتصوير في الجسم الحي من خلايا NK المستمدة من hESCs وiPSCs.
Abstract
فإننا نقدم وسيلة لاشتقاق الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من hESCs غير متمايزة وiPSCs باستخدام نهج خالية من وحدة التغذية. هذا الأسلوب يؤدي إلى مستويات عالية من الخلايا القاتلة الطبيعية بعد 4 أسابيع والثقافة، ويمكن أن تخضع لمزيد من التوسع 2 سجل مع الخلايا الاصطناعية تقديم المستضد. HESC والتوجيهية المشتقة من خلايا NK المتقدمة في هذا النظام يكون النمط الظاهري ناضجة وظيفة. إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا وراثيا تعديل NK ينطبق على كل من الآلية الأساسية فضلا عن دراسات المضادة للورم. التعبير عن luciferase يراعة في الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من HESC يسمح نهجا غير الغازية لمتابعة engraftment NK الخلية، والتوزيع، وظيفة. نحن أيضا وصف نظام ثنائي التصوير الذي يسمح رصد منفصلة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا لتوصيف بوضوح اكثر تفاعلاتها في الجسم الحي. هذا الأسلوب من الاشتقاق، والتوسع، ومزدوج في الجسم الحي التصوير يوفر نهجا يمكن الاعتماد عليها لإنتاج الخلايا القاتلة الطبيعية وتقييم واحدة منأوجه وهو أمر ضروري لتحسين العلاجات الحالية الخلية NK بالتبني.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) هي غير متمايزة، والخلايا المحفزة قادرة على التجديد الذاتي غير محدود ومتعدد النسب التمايز. وقد تم التفريق hESCs بنجاح إلى مجموعات فرعية ناضجة وظيفية من كل طبقة الجرثومية، بما في ذلك خلايا الجهاز المكونة للدم 1-3. الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي الخلايا الليمفاوية من نظام المناعة الفطرية التي يمكن استخلاصها من hESCs عن طريق تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) 4،5 أو الثقافة المشتركة مع خطوط الخلايا اللحمية 1،2،6-8. خلايا NK يمتلك امكانات المضادة للفيروسات والمضادة للورم ولها القدرة على أن تكون فعالة ضد طائفة واسعة من الأورام الخبيثة، كما أنها لا تتطلب التحفيز مستضد قبل أداء مهامهم المستجيب. وهكذا، وخلايا NK HESC المشتقة هي مصدر جاذبية للخلايا لعلاج مناعي. بالإضافة إلى ذلك، اشتقاق خلايا NK من hESCs يوفر نظام قابلة راثيا لدراسة التطور الطبيعي <EM> في المختبر.
لأنها توفر نظام لين العريكة وراثيا، وخلايا NK HESC المشتقة يمكن تعديل تجريبيا للتعبير عن صحفيين الفلورسنت وإضاءة الحيوية تقديم النموذج الأمثل لدراسة وظائف الخلية NK المستجيب في المختبر والمجراة. الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة HESC تمتلك النشاط ضد مجموعة من الأهداف بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية 9، وسرطان الدم (K562) وأنواع السرطان الأخرى 7،8. ومع ذلك، فإن القدرة على استخلاص ما يكفي من خلايا NK بكفاءة قادرة على علاج المرضى لا يزال يشكل عائقا هاما للترجمة السريرية و، وبدرجة أقل، وجود قيود واسعة النطاق لما قبل السريرية في الدراسات المجراة من تطوير خلايا NK وظائف مضادة للسرطان. هنا، ونحن نستخدم منهج EB تدور لاشتقاق الأسلاف المكونة للدم من hESCs 4،5،10. بعد 11 يوما يتم نقل تدور EBS لزراعة الخلايا NK مع أو بدون مغذيات لمدة 28 يوما. بعد 4 أسابيع في NK الخلية مستنبت، وخلايا NK هي ترانsferred إلى الثقافة المشتركة مع K562 الخلايا المعدلة للتعبير عن غشاء محدد انترلوكين 21 (IL-21)، والتي تكون بمثابة خلايا اصطناعية تقديم المستضد (aAPCs). التكيف بروتوكول للتوسع الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم الطرفية باستخدام هذه ناقلات الجنود المدرعة الاصطناعي 11،12، ونحن قادرون على توسيع خلايا NK-2 سجلات مع الحفاظ على النمط الظاهري ناضجة وقدرات السامة للخلايا.
هذه العملية من تطوير وتوسيع يوفر ما يكفي من خلايا NK HESC المشتقة لواسعة في توصيف الجسم الحي. لفي الدراسات المجراة، ونحن قادرون على مراقبة غير جراحية engraftment المدى الطويل وحركية حقن luciferase يراعة التعبير (Fluc +)، وخلايا NK HESC المشتقة باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي. وعلاوة على ذلك، نحن قادرون على متابعة التفاعلات الخلية NK مع الخلايا السرطانية باستخدام ونظام التصوير إضاءة الحيوية أو الفلورسنت المزدوج. تستخدم دراسة سابقة من قبل مجموعتنا التصوير تلألؤ بيولوجي في نموذج المضادة للورم لمتابعة تطور الورم وCLEarance من Fluc + K562 الخلايا في الجسم الحي 7. الآن، عن طريق الهندسة hESCs لدينا للتعبير عن luciferase يراعة 13،14 يمكننا اتباع biodistribution والاتجار بها خلايا NK إلى K562 الخلايا السرطانية التي تعبر عن بروتين فلوري تتميز مؤخرا، turboFP650 15. لقد اخترنا هذا النظام مراسل المزدوج من أجل متابعة في وقت واحد السكان الخلية اثنين في الجسم الحي (الشكل 1). وكانت نماذج التصوير المزدوج معظم أنظمة ثنائي وسيفيراز، ولكن هذه النظم يمكن أن يكون تحديا تقنيا نظرا لمتطلبات التسليم من coelenterazine، الركيزة اللازمة للتعبير عن معظم Renilla وGaussia صحفيين وسيفيراز 16-18. وقد سمح للصحفيين الفلورسنت رصد سهل من العديد من خطوط الخلايا ويبني في المختبر، ولكن تمت زيارتها النجاح المحدود لفي الجسم الحي التصوير بسبب التداخل بين الأنسجة والفراء تألق ذاتي وأطياف انبعاث العديد من المشاركينتستخدم mmonly صحفيين الفلورسنت بما في ذلك GFP، DsRed، وTdTomato 15،19. وقد شجع هذا الاهتمام في تطوير البروتينات الفلورية بعيدة الحمراء، والتي تسمح للأفضل انتفاذ الأنسجة وإشارة محددة أعلى بالمقارنة مع 15،19 الخلفية. TurboFP650، وبروتين فلوري هو مبين في هذا النظام، يتم إزاحة بعيدة الحمراء ويتغلب على العديد من القضايا المطروحة مع التصوير البروتينات الفلورية في الحيوانات الحية.
وقد أتاح هذا الأسلوب لتطوير وتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية المستمدة من hESCs لنا لمزيد من تميز الخلايا القاتلة الطبيعية HESC المشتقة في التجارب المختبرية والحية، وهو أمر ضروري من أجل فهم أفضل وظيفة خلايا NK وهامة سريريا لتحسين العلاجات الحالية الخلية NK بالتبني. بل هو أيضا قابلة للاشتقاق والتوسع في الخلايا القاتلة الطبيعية التوجيهية المشتقة. نظام التصوير الفلورسنت وإضاءة الحيوية المزدوج ينطبق على نطاق واسع لأنظمة أخرى من طراز المضادة للورم أظهرنا هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs هي منصة مثالية لدراسة أنواع الخلايا المتنوعة وعقد المحتملة ملحوظا للترجمة السريرية. ونحن نستخدم، وتدور نهج EB تعريف للتمييز HESC / iPSCs إلى الخلايا الاصلية المكونة للدم. وقد أسفرت النهج EB تدور اشتقاق ثابت من الخلايا الاصلية المكونة للدم والتمايز إلى خلايا NK، ومع ذلك، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ميليندا Hexum إلى الشروع في تنفيذ بروتوكول EB تدور داخل مختبرنا. ونود أن نشكر أعضاء آخرين في المختبر، بما في ذلك لورا E. Bendzick، مايكل Lepley، وجينيا ني للحصول على المساعدة الفنية مع هذا العمل. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر براد تايلور في علوم الحياة الفرجار لله المشورة الفنية للخبراء.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
