Entwicklung, Erweiterung und<em> In vivo</em> Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung, Expansion und in-vivo-Bildgebung von NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet.
Abstract
Wir präsentieren eine Methode zur Ableitung natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) aus undifferenzierten hES und iPS mit einem Feeder-freien Ansatz. Diese Methode ergibt sich ein hohes Maß an NK-Zellen nach 4 Wochen Kultur und weitere 2-log Expansion mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen zu unterziehen. hESC-und iPS-abgeleiteten NK-Zellen in diesem System entwickelt haben eine reife Phänotyp und Funktion. Die Produktion einer großen Anzahl von NK-Zellen genetisch veränderbar gilt sowohl für grundlegende mechanistische sowie Anti-Tumor-Studien. Expression der Firefly-Luciferase in hES-Zellen abgeleiteten NK ermöglicht eine nicht-invasive Ansatz zur NK-Zell-Transplantation, Verteilung und Funktion folgen. Wir beschreiben auch ein Dual-Bildgebungsverfahren, das eine getrennte Überwachung von zwei verschiedenen Zellpopulationen zu deutlicher charakterisieren ihre Wechselwirkungen in vivo ermöglicht. Diese Art der Ableitung, Expansion und zwei in-vivo-Bildgebung eine zuverlässige Methode zur Herstellung von NK-Zellen und deren ausgewertetation, die zur aktuellen NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern.
Introduction
Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sind undifferenzierte, pluripotente Zellen, die sich unbegrenzt Selbsterneuerung und Differenzierung multi-Linie. hESCs wurden erfolgreich in reifen und funktionale Untergruppen von jedem Keimblatt, einschließlich Zellen des blutbildenden Systems 1-3 unterschieden. Natürliche Killerzellen (NK)-Zellen sind Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, von HES durch Bildung von embryoid bodies (EBs) 4,5 oder Co-Kultur mit Zelllinien 1,2,6-8 Stromazellen abgeleitet werden. NK-Zellen besitzen anti-virale und anti-Tumor-Fähigkeiten und das Potential haben, sich gegen ein breites Spektrum von Tumoren wirksam, da sie keiner vorherigen Antigen-Stimulation zu ihren Effektorfunktionen durchzuführen. Somit sind hESC abgeleiteten NK-Zellen eine attraktive Quelle von Zellen für die Immuntherapie. Zusätzlich stellt die Ableitung von NK-Zellen aus HES ein genetisch zugänglich, um den normalen Entwicklung zu studieren <em> in vitro.
Weil sie eine genetisch manipulierbaren System bereitzustellen, kann hESC abgeleiteten NK Zellen experimentell modifiziert werden, um Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter exprimieren einen optimalen Modell NK-Zell-Effektorfunktionen in vitro und in vivo zu studieren. hESC abgeleiteten NK-Zellen besitzen Wirkung gegen eine Reihe von Zielen, einschließlich HIV 9, Leukämie (K562) und andere Krebsarten 7,8. Jedoch ist die Fähigkeit, effizient ableiten genug NK Zellen, zur Behandlung von Patienten vor ein erhebliches Hindernis für die klinische Übersetzung und zu einem geringeren Grad, eine Beschränkung für umfangreiche präklinischen in vivo-Untersuchungen der NK-Zell-Entwicklung und Anti-Krebs-Funktionen. Hier verwenden wir ein Spin EB Ansatz zur Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hESCs 4,5,10. Nach 11 Tage der Spin EBs sind NK-Zell-Kultur mit oder ohne Feeder für 28 Tage übertragen. Nach 4 Wochen in NK Zellkulturmedium, NK-Zellen transferred zu Co-Kultur mit K562-Zellen modifiziert werden, um membrangebundene Interleukin 21 (IL-21), die als künstliche Antigen präsentierende Zellen (aAPCs) dienen auszudrücken. Anpassung ein Protokoll für den Ausbau der peripheren Blut NK-Zellen mit diesen künstlichen APCs 11,12, sind wir in der Lage zu expandieren NK-Zellen 2-Protokolle unter Beibehaltung einer reifen Phänotyp und zytotoxische Fähigkeiten.
Dieser Prozess der Entwicklung und Expansion bietet ausreichend hESC abgeleiteten NK-Zellen für umfangreiche in vivo Charakterisierung. Für in-vivo-Studien, können wir nicht-invasiv überwacht langfristig Transplantation und die Kinetik der injizierten Glühwürmchenluciferase sind Ausdruck (Fluc +), hESC abgeleiteten NK-Zellen mit Biolumineszenz-Bildgebung. Darüber hinaus sind wir in der Lage, NK-Zell-Interaktionen mit Tumorzellen mit einem Dual, Biolumineszenz oder Fluoreszenz-Imaging-Schema folgen. Eine frühere Studie von unserer Gruppe verwendet Biolumineszenz-Bildgebung in einem Anti-Tumor-Modell bis zur Tumorprogression und cle folgenarance von Fluc + K562-Zellen in vivo 7. Nun, von Engineering bis hESCs unsere ausdrückliche Glühwürmchenluciferase 13,14 können wir die biologische Verteilung und Handel von NK Zellen K562 Tumorzellen, die das kürzlich charakterisierten fluoreszierendes Protein exprimieren turboFP650 15 folgen. Wir haben dieses duale System Reporter ausgewählt, um gleichzeitig folgen die beiden Zellpopulationen in vivo (Abbildung 1). Die meisten Dual Imaging Modelle haben Dual-Luciferase-Systeme, aber diese Systeme technisch eine Herausforderung aufgrund der Lieferbedingungen von Coelenterazin, das Substrat für die Expression der meisten Renilla Luciferase Reporter und Gaussia 16-18 erforderlich. Fluorescent Reporter haben eine einfache Überwachung von vielen Zelllinien und Konstrukte in vitro erlaubt, hat aber nur begrenzten Erfolg hatten in-vivo-Bildgebung aufgrund der Überlappung zwischen Gewebe und Fell Autofluoreszenz und Emissionsspektren von vielen commonly verwendet fluoreszierenden Reporter einschließlich GFP, DsRed und tdTomato 15,19. Diese Sorge hat die Entwicklung der weit rot fluoreszierende Proteine, die für eine bessere Gewebe Penetranz und höhere spezifische Signal im Vergleich zu 15,19 Hintergrund erlauben gefördert. TurboFP650, das fluoreszierende Protein in diesem System gezeigt, ist weit-Rot verschoben und überwindet viele der Probleme, mit bildgebenden fluoreszierenden Proteinen in lebenden Tieren.
Dieses Verfahren für die Entwicklung und den Ausbau von NK-Zellen hESCs abgeleitet hat uns erlaubt, weiter zu charakterisieren hESC abgeleiteten NK-Zellen in vitro und in vivo, die erforderlich sind, um besser zu verstehen, NK-Zell-Funktion und klinisch wichtig, aktuelle NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern. Es ist auch offen für die Ableitung und Erweiterung iPSC abgeleiteten NK-Zellen. Das duale Fluoreszenz und Biolumineszenz-Imaging-System ist breit anwendbar auf andere Systeme als die Anti-Tumor-Modell, das wir hier gezeigt haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs sind eine ideale Plattform, um verschiedene Zelltypen zu studieren und halten bemerkenswerte Potenzial für die klinische Übersetzung. Wir verwenden eine definierte, Spin EB Ansatz hESC / iPSCs auf hämatopoetischen Vorläuferzellen zu differenzieren. Der Spin EB Ansatz konsistente Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und Differenzierung auf NK-Zellen ergab, doch, Variation existiert noch in Differenzierung Effizienz in Zelllinien und müssen für die Erzeugung von anderen hämatopoetischen Zelllinien…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Melinda Hexum zur Initiierung der Spin EB Protokoll danken in unserem Labor. Wir möchten an die anderen Mitglieder des Labors, darunter Laura E. Bendzick, Michael Lepley und Zhenya Ni für ihre technische Unterstützung bei dieser Arbeit danken. Die Autoren möchte auch Brad Taylor bei Caliper Life Sciences danken für seine kompetente technische Beratung.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
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