Geliştirme, Genişleme ve<em> In vivo</em> İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)
Summary
Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.
Abstract
Biz bir besleyici içermeyen bir yaklaşım kullanarak farklılaşmamış hESC ve iPSCs doğal öldürücü (NK) hücreleri türetmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, 4 hafta kültürden sonra NK hücreleri, yüksek düzeyde sebebiyet verir ve yapay antijen sunan hücreler ile daha fazla 2-Geçmiş genişleme tabi olabilir. Bu sistemde geliştirilmiş hESC ve iPSC türetilmiş NK hücreleri, olgun fenotip ve fonksiyona sahiptir. Genetik olarak değiştirilebilir, NK hücreleri çok sayıda üretim hem temel hem mekanistik hem de anti-tümör çalışmaları için de geçerlidir. HESC kaynaklı NK hücrelerinde ateşböceği lusiferaz ifade non-invaziv bir yaklaşım NK hücre nakli, dağıtım, ve fonksiyon izlemenizi sağlar. Ayrıca, iki farklı hücre popülasyonlarının ayrı izleme daha belirgin bir biçimde in vivo etkileşimlerini karakterize sağlayan bir çift görüntüleme düzeni açıklanmaktadır. In vivo görüntüleme türetme, genişleme, ve çift bu yöntem güvenilir bir NK hücreleri üretmek için bir yaklaşım ve değerlen sağlarMevcut NK hücre evlatlık tedaviler geliştirmek için gereklidir tirme.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) sınırsız kendini yenileme ve çok soy farklılaşma yeteneğine sahip farklılaşmamış, pluripotent hücrelerdir. hESC başarıyla 1-3 hematopoetik sistem hücreleri dahil olmak üzere her germ tabakasının olgun ve işlevsel alt, içine ayırt edilmiştir. Doğal öldürücü (NK) hücreleri, stromal hücre hatları 1,2,6-8 ile embriyoid cisimlerin formasyonu (EBS) 4,5 ya da ko-kültür ile hESC elde edilebilir doğuştan gelen bağışıklık sistemi lenfositlerdir. NK hücreleri, anti-viral ve anti-tümör özellikleri sahiptir ve önceden antijen stimülasyonu bunların efektör fonksiyonları gerçekleştirmek için gerekli olmayacağı için, maligniteler geniş bir yelpazesine karşı etkili olma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, hESC elde edilen NK hücreleri immünoterapi için bir hücre için cazip bir kaynak bulunmaktadır. Ayrıca, hESC NK hücrelerinin türetme normal gelişimini incelemek için bir genetik mükellef sistemi sağlar <em> in vitro.
Bir genetik uysal sistemi sağlamak için, hESC elde edilen NK hücreleri deneysel olarak in vitro ve in vivo olarak NK hücre efektör fonksiyonlarını incelemek için bir optimal model sağlayan flüoresan ve biyolüminesans muhabir ifade için modifiye edilebilir. hESC elde edilen NK hücreleri, HIV 9, lösemi (K562) ve diğer kanser türlerinde 7,8 dahil olmak üzere hedef bir dizi karşı etkinliğe sahiptir. Bununla birlikte, bu verimli bir şekilde daha az bir ölçüde, NK hücre gelişimi ve anti-kanser fonksiyonları in vivo çalışmalarda geniş bir klinik öncesi için bir sınırlama, hastaların tedavisinde kapasitesine kadar NK hücreleri klinik çeviri için önemli bir engel olmaya devam etmektedir ve bir edilmesidir. Burada, hESC 4,5,10 gelen hematopoetik atalarıdır elde etmek için bir spin EB yaklaşım kullanın. 11 gün sonra sıkma EBS 28 gün boyunca besleyiciler olan veya olmayan NK hücre kültürü aktarılır. NK hücre kültür ortamı içinde 4 hafta sonra, NK hücrelerinin tran vardıryapay antijen sunan hücreler (aAPCs) olarak görev yapar, membrana bağlı, interlökin 21 (IL-21) ifade etmek için modifiye K562 hücreleri ile birlikte-kültür sferred. Bu yapay APC 11,12 ile periferik kan NK hücrelerinin genişlemesi için bir protokol uyarlanması, biz olgun bir fenotip ve sitotoksik özellikleri koruyarak NK hücreleri 2-günlükleri genişletmek edebiliyoruz.
Gelişme ve genişleme süreci vivo karakterizasyonu geniş için yeterli hESC elde edilen NK hücreleri sağlar. In vivo çalışmalar için, ifade non-invaziv enjekte ateşböceği lusiferaz uzun vadeli uyumunu ve kinetik takip edebiliyoruz (Fluc +), biyolüminesans görüntüleme kullanarak hESC kaynaklı NK hücreleri. Ayrıca, bir çift, biyolüminesans veya floresan görüntüleme düzeni kullanarak tümör hücreleri ile NK hücre etkileşimleri takip edebiliyoruz. Grubumuz tarafından önceki bir çalışmada tümör ilerlemesi ve cle takip için bir anti-tümör modelinde biyoparlaklık görüntüleme kullanılanin vivo 7 Fluc + K562 hücrelerinin arance. Şimdi, ifade ateşböceği lusiferaz 13,14 için hESC mühendislik tarafından biz son zamanlarda karakterize floresan proteini, turboFP650 15 ifade K562 tümör hücrelerine NK hücrelerinin biodistribution ve ticareti takip edebilirsiniz. Biz aynı anda in vivo iki hücre popülasyonlarının (Şekil 1) takip etmek için bu ikili muhabir sistemi seçtiniz. En çift görüntüleme modelleri çift lusiferaz sistemleri olmuştur, ancak bu sistemlerin teknik nedeniyle coelenterazine teslim ihtiyaçlarına zor olabilir, yüzey en Renilla ve Gaussia lusiferaz gazetecilere 16-18 ifadesi için gerekli. Floresan gazetecilere birçok hücre hatları ve in vitro yapıları kolay izleme izin, ama nedeniyle doku ve kürk otofloresans ve birçok işbirliği emisyon spektrumları arasındaki örtüşme in vivo görüntüleme için sınırlı başarı elde ettimmonly GFP, DsRed ve tdTomato 15,19 dahil olmak üzere floresan gazetecilere kullanılır. Bu endişe daha iyi doku penetrans ve arka plan 15,19 göre daha yüksek belirli bir sinyal için izin uzak-kırmızı floresan proteinleri, gelişimini teşvik etmiştir. TurboFP650, bu sistem gösterilen floresan proteini, uzak-kırmızı değiştirdi ve yaşayan hayvanlarda görüntüleme floresan proteinleri ile ilgili sorunların çoğu üstesinden gelir.
HESC elde edilen NK hücreleri geliştirmek ve genişletmek için bu yöntem bize daha fazla in vitro ve daha iyi mevcut NK hücre evlatlık tedaviler geliştirmek için NK hücre fonksiyonu ve klinik olarak önemli anlamak için gerekli in vivo, in hESC elde edilen NK hücreleri karakterize etmek için izin verdi. Ayrıca türetme ve iPSC kökenli NK hücrelerinin genişlemesi için müsait. Çift Floresan ve biyolüminesans görüntüleme düzeni burada göstermiştir anti-tümör modeli başka sistemlere genel olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESC farklı hücre tipleri çalışma ve klinik çeviri için önemli potansiyel tutmak için ideal bir platform. Biz hematopoetik progenitör hücrelere hESC / iPSCs ayırt etmek için tanımlanmış bir, dönüş EB yaklaşım kullanın. Spin EB yaklaşım NK hücrelerine hematopoetik progenitör hücreler ve farklılaşma tutarlı türev vermiştir, ancak, değişim hala hücre hatları üzerinden farklılaşması verimliliği var ve diğer hematopoetik hücre soylarının üretimi için değiştirilmesi gerekebilir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bizim laboratuar içinde spin EB protokolün başlatılması için Melinda Hexum teşekkür etmek istiyorum. Biz Laura E. Bendzick, Michael Lepley, ve bu çalışma ile teknik yardım için Zhenya Ni de dahil olmak üzere laboratuvar diğer üyeleri, teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar aynı zamanda onun uzman teknik danışmanlık için Kaliper Yaşam Bilimleri Brad Taylor teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
