개발, 확대,<em> 생체 내</em> 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)
Summary
이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.
Abstract
우리는 장치가없는 방식을 사용하여 미분화 hESCs에와 유도 만능의 자연 킬러 (NK) 세포를 유도하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 4 주 배양 후 NK 세포의 높은 수준에 상승을 제공하고 인공 항원 제시 세포와 추가로 2 로그 확장을 겪을 수 있습니다. 이 시스템에서 개발 hESC의 및 IPSC 유래 NK 세포는 성숙한 표현형과 기능이 있습니다. 유전자 수정 NK 세포의 큰 숫자의 생산은 모두 기본 기계론뿐만 아니라 안티 종양 연구에 적용 할 수 있습니다. hESC의 유래 NK 세포의 반딧불 루시 페라 제의 발현은 비 침습적 방법은 NK 세포의 생착, 배포 및 기능을 따라 할 수 있습니다. 우리는 또한 두 개의 서로 다른 세포 집단 별도의 모니터링이 더 뚜렷하게 생체 내에서의 상호 작용을 특성화 할 수있는 이중 영상 방식을 설명합니다. 생체 내 이미징에서 파생, 확장 및 듀얼이 방법은 신뢰할 수있는 NK 세포를 생산하는 방법과 그 evalu를 제공합니다현재 NK 세포 입양 요법을 개선 할 필요가있다 ATION.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)와 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)는 무제한 자기 갱신과 멀티 혈통 분화 할 수있는 미분화, 만능 세포입니다. hESCs는 성공적으로 1-3 조혈 시스템의 세포를 포함한 각 세균 층의 성숙과 기능 하위 집합으로 구분되었다. 자연 킬러 (NK) 세포 기질 세포 라인 1,2,6-8와 배아 체 형성 (사채) 4,5 또는 공동 문화 hESCs는에서 파생 될 수있는 타고난 면역 시스템의 림프구이다. NK 세포는 항 바이러스 및 항 종양 기능을 보유하고 이전 항원 자극이 자신의 이펙터 기능을 수행하기 위해 필요로하지 않는 한, 악성의 넓은 범위에 적용 할 수있는 잠재력이있다. 따라서, hESC의 유래 NK 세포는 면역에 대한 세포의 매력적인 소스입니다. 또한, hESCs는에서 NK 세포의 유도는 정상적인 발달을 연구하는 유전자 의무가 시스템을 제공합니다 <EM> 체외합니다.
그들은 유전자 다루기 쉬운 시스템을 제공하기 때문에, hESC의 유래 NK 세포는 실험적으로 in vitro와 in vivo에서 NK 세포 이펙터 기능을 연구하는 최적의 모델을 제공 형광 발광 기자를 표현하기 위해 수정할 수 있습니다. hESC의 유래 NK 세포는 HIV 9 백혈병 (K562) 및 기타 암 종류 7,8 등 대상의 범위에 대한 활동을 소유한다. 그러나 능력을 효율적으로 낮은 수준, NK 세포 개발 및 항암 기능의 생체 내 연구에서 광범위한 전임상에 대한 제한, 환자를 치료 할 수있는 충분한 NK 세포는 임상 번역에 대한 중요한 장벽이 남아있다 파생한다. 여기, 우리는 hESCs는 4,5,10에서 조혈 전구 세포를 파생 스핀 EB 방식을 사용합니다. 십일일 다음 스핀 사채 28 명의 일 지류의 유무에 관계없이 NK 세포 배양에 전송됩니다. NK 세포 배양 배지에서 4 주 후에, NK 세포는 트란 있습니다인공 항원 제시 세포 (AAPCS)의 역할을 막 바인딩 된 인터루킨 21 (IL-21)을 표현하도록 수정 K562 세포와 공동 배양에 sferred. 이러한 인공 장갑차 11,12을 사용하여 말초 혈액 NK 세포의 확장을위한 프로토콜을 적응, 우리는 성숙한 표현형과 세포 독성 기능을 유지하면서 NK 세포 2 – 로그를 확장 할 수 있습니다.
개발 및 확장이 과정은 생체 내 특성의 광범위에 충분한 hESC의 유래 NK 세포를 제공합니다. 생체 연구를 위해, 우리가 표현하는 비 침습적 주입 반딧불 루시 페라 제의 장기간의 생착과 반응 속도를 모니터링 할 수 있습니다 (Fluc이 +), 생물 발광 영상을 사용하여 hESC의 유래 NK 세포. 또한, 우리는 이중 발광 또는 형광 이미징 기법을 사용하여 종양 세포와 NK 세포의 상호 작용을 따를 수 있습니다. 우리 그룹에 의해 이전 연구는 종양의 진행과 사이클을 따라 안티 종양 모델에서 생물 발광 영상을 사용생체 내 7 Fluc + K562 세포의 arance. 지금, 익스프레스 반딧불 루시 페라 제 13,14에 우리의 hESCs는 꾸민하여 우리는 최근 특징 형광 단백질, turboFP650 15을 표현 K562 종양 세포에 대한 NK 세포의 생체 분포와 인신 매매를 볼 수 있습니다. 우리는 동시에 생체 내에서 두 개의 세포 집단 (그림 1)에 따라하기 위해이 이중 리포터 시스템을 선택했습니다. 대부분의 듀얼 이미징 모델은 듀얼 – 루시퍼 시스템 왔지만, 이러한 시스템은 기술적으로 인해 coelenterazine의 배달 요구 사항에 도전 할 수있는, 기판은 대부분 Renilla의와 Gaussia 루시 페라 제 기자 16-18의 표현이 필요합니다. 형광 기자는 많은 세포 라인과 생체 구조를 쉽게 모니터링을 허용했지만, 때문에 조직과 모피자가 형광과 많은 공동의 방출 스펙트럼 사이의 중복에 생체 내 이미징에 대한 제한적인 성공을 거두었습니다mmonly GFP,는 DsRed, 그리고 TdTomato 15,19 등의 형광 기자를 사용했습니다. 이러한 우려는 더 나은 조직 투과도 및 배경 15,19에 비해 높은 특정 신호 수 원적외선 형광 단백질의 발전을 격려했다. TurboFP650이 시스템에 표시되는 형광 단백질은 원적외선 이동하고 살아있는 동물 이미징 형광 단백질과 관련된 많은 문제를 극복한다.
hESCs는에서 파생 된 NK 세포를 개발하고 확장이 방법은 우리가 더 체외에서 더 나은 현재 NK 세포 입양 요법을 개선하는 NK 세포의 기능 및 임상 적으로 중요한을 이해하는 데 필요한 생체 내에서 hESC의 유래 NK 세포를 특성화 할 수있다. 또한 유도와 IPSC 파생 NK 세포의 확장 의무이다. 이중 형광 및 발광 생물 이미징 방식은 우리가 여기에 표시 한 항 종양 모델보다 다른 시스템에 광범위하게 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs는이 다양한 세포 유형을 연구 및 임상 번역에 대한 놀라운 잠재력을 보유하는 이상적인 플랫폼입니다. 우리는 조혈 전구 세포로 hESC의 / 유도 만능를 구분하는 정의, 스핀 EB 방식을 사용합니다. 스핀 EB 방식은 NK 세포 조혈 전구 세포 분화의 일관성있는 유도를 나왔고, 아직 변화는 여전히 세포 라인에 걸쳐 분화 효율 존재하고 다른 조혈 세포 계통의 생성을 위해 수정해야 할 수도 있습니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 우리가 실험실에서 스핀 EB 프로토콜의 초기화에 대한 멜린다 Hexum에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 로라 E. Bendzick, 마이클 Lepley,이 작품과의 기술 지원을 Zhenya 니켈 등 실험실의 다른 구성원을 감사드립니다. 저자는 또한 그의 전문 기술 조언 캘리퍼스 생명 과학에서 브래드 테일러에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
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