Le développement, l'expansion et<em> In vivo</em> Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)
Summary
Ce protocole décrit le développement, l'expansion et l'imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.
Abstract
Nous présentons une méthode pour dériver des cellules tueuses naturelles (NK) à partir de CSEh et iPSCs indifférenciées en utilisant une approche chargeur sans. Cette méthode donne lieu à des taux élevés de cellules NK après 4 semaines de culture et peut subir une expansion de 2 log avec des cellules présentatrices de l'antigène artificielles. Les cellules NK CSEh et iPSC dérivé développés dans ce système ont un phénotype et la fonction mature. La production d'un grand nombre de cellules NK modifiables génétiquement est applicable à la fois mécaniste de base ainsi que des études anti-tumorales. Expression de la luciférase de luciole dans les cellules NK CSEh dérivées permet une approche non invasive pour suivre la prise de greffe de cellules NK, la distribution, et la fonction. Nous décrivons également un double système d'imagerie qui permet une surveillance séparée des deux populations de cellules différentes de caractériser plus nettement leurs interactions in vivo. Ce mode de dérivation, l'expansion, et la double imagerie in vivo fournit une approche fiable de production de cellules NK et leur évaation qui est nécessaire pour améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK.
Introduction
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes indifférenciées capables d'auto-renouvellement et de multi-lignée différenciation illimitée. hESCs ont été différenciés avec succès en sous-ensembles matures et fonctionnelles de chaque couche de germe, y compris des cellules du système hématopoïétique 3.1. Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes du système immunitaire inné qui peut être obtenue à partir de cellules hES par la formation de corps embryoïdes (EBS) 4,5 ou co-culture avec des lignées de cellules stromales 1,2,6-8. Les cellules NK possèdent des capacités anti-virales et anti-tumorale et ont le potentiel pour être efficace contre un large éventail de cancers, car ils ne nécessitent pas la stimulation antigénique avant d'exercer leurs fonctions effectrices. Ainsi, les cellules CSEh dérivées NK sont une source intéressante de cellules pour l'immunothérapie. En outre, la dérivation de cellules NK de CSEh fournit un système génétiquement prête à étudier le développement normal <em> in vitro.
Parce qu'ils fournissent un système génétiquement traitable, les cellules NK CSEh dérivées peuvent être expérimentalement modifiées pour exprimer les journalistes fluorescentes et bioluminescente fournissant un modèle optimal pour étudier NK fonctions effectrices cellulaires in vitro et in vivo. Les cellules NK CSEh dérivées possèdent une activité contre une gamme d'objectifs, y compris le VIH 9, la leucémie (K562) et d'autres types de cancer 7,8. Cependant, la capacité à tirer efficacement suffisamment de cellules NK capables de traiter les patients reste un obstacle important pour la traduction clinique et, dans une moindre mesure, une limitation pour une vaste pré-cliniques in vivo du développement des cellules NK et des fonctions anti-cancéreuses. Ici, nous utilisons une approche de EB de spin de tirer progéniteurs hématopoïétiques à partir de CSEh 4,5,10. Après 11 jours, le tour EB sont transférés à la culture des cellules NK avec ou sans mangeoires pour 28 jours. Après 4 semaines dans un milieu de culture de cellules NK, les cellules NK sont transferred de co-culture avec des cellules K562 modifiées pour exprimer liée à la membrane de l'interleukine 21 (IL-21), qui servent de cellules présentatrices de l'antigène artificielles (VAMP). Adaptation d'un protocole pour l'expansion des cellules NK du sang périphérique à l'aide de ces APC artificielle 11,12, nous sommes en mesure de développer des cellules NK 2-logs tout en conservant un phénotype mature et capacités cytotoxiques.
Ce processus de développement et d'expansion prévoit cellules CSEh dérivées NK suffisantes pour extensif dans la caractérisation in vivo. Pour les études in vivo, nous sommes en mesure de surveiller de manière non invasive la prise de greffe à long terme et la cinétique de la luciférase de luciole injecté exprimer (Fluc +), les cellules NK CSEh dérivées utilisant l'imagerie par bioluminescence. En outre, nous sommes en mesure de suivre les interactions des cellules NK avec des cellules tumorales en utilisant un schéma d'imagerie double, bioluminescents ou fluorescent. Une étude antérieure de notre groupe a utilisé l'imagerie par bioluminescence dans un modèle anti-tumorale de suivre la progression tumorale et clearance de + cellules Fluc K562 in vivo 7. Maintenant, en repensant nos CSEh pour exprimer la luciférase de luciole 13,14, nous pouvons suivre la biodistribution et la traite des cellules NK à K562 cellules tumorales qui expriment la protéine fluorescente récemment caractérisé, turboFP650 15. Nous avons choisi ce système de double journaliste afin de suivre simultanément les deux populations de cellules in vivo (figure 1). La plupart des modèles double d'imagerie ont été systèmes à double luciférase, mais ces systèmes peuvent être techniquement difficile en raison des exigences de livraison de coelentérazine, le substrat nécessaire à l'expression de la plupart Renilla et Gaussia journalistes luciférase 16-18. Reporters fluorescents ont permis un contrôle facile de nombreuses lignées cellulaires et des constructions in vitro, mais a eu un succès limité pour l'imagerie in vivo en raison du chevauchement entre les tissus et autofluorescence de la fourrure et les spectres d'émission de plusieurs commonly utilisé reporters fluorescents dont GFP, DsRed et tdTomato 15,19. Cette préoccupation a encouragé le développement de protéines fluorescentes rouge lointain, qui permettent de mieux pénétrance de tissu et un signal spécifique plus élevée par rapport au fond 15,19. TurboFP650, la protéine fluorescente montré dans ce système, est décalée rouge lointain et à bout de bien des enjeux avec des protéines fluorescentes imagerie chez les animaux vivants.
Cette méthode de développement et l'expansion des cellules NK provenant de CSEh nous a permis de mieux caractériser les cellules CSEh dérivées NK in vitro et in vivo, ce qui est nécessaire pour mieux comprendre la fonction des cellules NK et cliniquement important d'améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK. Il est également prête à la dérivation et l'expansion des cellules NK iPSC-dérivées. Le système d'imagerie double fluorescent et bioluminescence est largement applicable à d'autres systèmes que le modèle anti-tumorale, nous avons montré ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
CSEh sont une plateforme idéale pour étudier divers types de cellules et maintenir un potentiel considérable de traduction clinique. Nous utilisons une approche EB rotation définies pour différencier les CSEh / iPSCs de cellules souches hématopoïétiques. L'approche de l'EB de spin a donné dérivation cohérente de cellules souches hématopoïétiques et la différenciation de cellules NK, et pourtant, variation existe encore dans l'efficacité de différenciation dans les lignées cellulaires et peu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Melinda Hexum pour l'initiation du protocole d'EB de rotation au sein de notre laboratoire. Nous tenons à remercier les autres membres du laboratoire, y compris Laura E. Bendzick, Michael Lepley, et Zhenya Ni pour leur assistance technique à ce travail. Les auteurs tiennent également à remercier Brad Taylor à Caliper Life Sciences pour son expertise technique.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
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