開発、展開、および<em生体内で></em>ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）
Summary
このプロトコルは、開発、展開、およびヒトES細胞やiPS細胞から派生したNK細胞のin vivoイメージングを説明しています。
Abstract
私たちは、フィーダーフリーのアプローチを使用して未分化ヒトES細胞やiPS細胞からナチュラルキラー（NK）細胞を導出する手法を提案する。この方法は、4週間培養した後、NK細胞の高レベルの上昇を与え、人工抗原提示細胞をさらに2ログ膨張を受けることができる。このシステムで開発されたヒトES細胞とiPS細胞由来のNK細胞が成熟した表現型と機能を持っています。遺伝的に変更可能なNK細胞の多数の製造は、基本的なメカニズムの、ならびに抗腫瘍の研究の両方に適用可能である。 hESC由来NK細胞にホタルルシフェラーゼの発現は、非侵襲的なアプローチは、NK細胞移植、分布、および関数に従うことができます。また、二つの異なる細胞集団の別個のモニターがよりはっきりとin vivoでの相互作用を特徴付けることができ、デュアル撮像方式を説明する。この導出方法、拡大、およびin vivoイメージングのデュアルは、NK細胞とその評を製造するための信頼性のあるアプローチを提供します現在のNK細胞養子治療法を改善する必要があるATION。
Introduction
ヒト胚性幹細胞（ES細胞）と人工多能性幹細胞（iPS細胞）無制限の自己再生および多系統分化することができる未分化多能性細胞である。ヒトES細胞が正常に1-3造血系の細胞を含むそれぞれの胚芽層の成熟と機能的なサブセットに分化してきた。ナチュラルキラー（NK）細胞は、間質細胞株1,2,6-8を有する4,5又は共培養胚様体（EB）を形成することによってヒトES細胞から誘導することができる自然免疫系のリンパ球である。 NK細胞は、抗ウイルスおよび抗腫瘍機能を有し、彼らのエフェクター機能を実行する前の抗原刺激を必要としないので、悪性腫瘍の広い範囲に対して有効である可能性があります。したがって、hESC由来NK細胞は免疫療法のための細胞の魅力源です。また、ヒトES細胞からNK細胞の導出は正常な発達を研究するために遺伝的に影響を受けやすいシステムを提供しています<in vitroでemが>。
それらは遺伝的に扱いやすいシステムを提供するので、ヒトES細胞由来のNK細胞は、実験的に、 インビトロおよびインビボで NK細胞のエフェクター機能を研究するための最適なモデルを提供し、生物発光、蛍光リポーターに発現するように改変することができる。ヒトES細胞由来のNK細胞は、HIV 9、白血病（K562）と他の癌のタイプ7,8を含むターゲットの範囲に対して活性を有する。しかし、効率的に患者を治療することのできる十分なNK細胞を導出する能力は、臨床翻訳のための重要な障壁ままで、より少ない程度、NK細胞の発達および抗癌機能のインビボ研究前臨床広範囲の制限にある。ここでは、ヒトES細胞4,5,10から造血前駆細胞を導出するスピンEBのアプローチを使用しています。 11日に続いてスピンEBを、28日間フィーダの有無にかかわらず、NK細胞培養に転送されます。 NK細胞培養培地中で4週間後、NK細胞は、過渡ある膜結合型人工抗原提示細胞（AAPCS）としてインターロイキン21（IL-21）を、表現するために修正されたK562細胞との共培養にsferred。これらの人工のAPC 11,12を使用して末梢血NK細胞の増殖のためのプロトコルを適応させる、我々は成熟した表現型および細胞毒性機能を保持しながら、NK細胞2 -ログを拡張することができます。
発展と拡大するこのプロセスは、in vivo特性評価における広範に十分なhESC由来NK細胞を提供する。 in vivo試験では、私たちは、非侵襲的に生物発光イメージングを使用して長期生着と動態（Fluc +）を発現する、注入ホタルルシフェラーゼ、hESC由来NK細胞をモニターすることができます。さらに、我々は、二重の生物発光又は蛍光撮像方式を用いて腫瘍細胞とNK細胞の相互作用に従うことができる。私たちのグループによる以前の研究では、腫瘍の進行とCLEに従う抗腫瘍モデルでは生物発光イメージングを使用した生体7 Fluc + K562細胞のarance。さて、急行ホタルルシフェラーゼ13,14に当社のヒトES細胞を工学的に我々は最近特徴付け蛍光タンパク質、turboFP650 15を表現K562腫瘍細胞にNK細胞の生体内分布と人身売買に従うことができます。我々は、同時に生体内における 2つの細胞集団（ 図1）に従うために、この二重レポーター系を選択した。ほとんどのデュアルイメージングモデルは、デュアルルシフェラーゼシステムでしたが、これらのシステムは、技術的に原因セレンテラジン、最もウミとガウルシフェラーゼレポーター16-18の発現に必要な基板の配信要件に挑戦することができます。蛍光レポーターは、in vitroで 、多くの細胞株と構造の監視を簡単に行うことが許されているが、組織と毛皮自家蛍光と多くの共同の発光スペクトルの重なりに起因する生体イメージングのための限られた成功を収めてきましたmmonly GFP、DsRedの、そしてTdTomato 15,19含む蛍光レポーターを使用していました。この懸念は、より良い組織の浸透度と背景15,19に比べ、より高い特定の信号を可能に遠赤色蛍光タンパク質の開発を奨励してきた。 TurboFP650、このシステムに示す蛍光タンパク質は、シフトした遠赤で、生きた動物でのイメージング蛍光タンパク質に関わる問題の多くを克服する。
ヒトES細胞由来のNK細胞を開発し、拡大するためのこの方法は、私たちはさらに、in vitroおよび現在のNK細胞養子 治療法を改善する優れたNK細胞の機能を理解するために必要な、臨床的に重要である生体内の hESC由来NK細胞を特徴付けることができました。また、派生とiPS細胞由来のNK細胞の増殖に適しています。デュアル蛍光と生物発光イメージング方式では、我々がここに示されている抗腫瘍モデル以外のシステムに広く適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒトES細胞は、多様な種類の細胞を研究し、臨床的な翻訳のための顕著な潜在力を保持するための理想的なプラットフォームです。私たちは、造血前駆細胞にヒトES細胞/ iPS細胞を区別するために定義され、スピンEBのアプローチを使用しています。スピンEBアプローチは、NK細胞へ造血前駆細胞および分化の一貫した誘導が得られている、まだ、ばらつきが依然として細胞系全体の分化効率が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、私たちの研究室の中でスピンEBプロトコルの開始のためメリンダHexumに感謝したいと思います。私たちは、この作品で彼らの技術支援のためにローラE. Bendzick、マイケルLepley、とジェーニャNiを含む研究室の他のメンバーに感謝したいと思います。著者はまた、彼の専門的技術的助言のためにキャリパーライフサイエンスでブラッド·テイラーに感謝したいと思います。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
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