Udvikling, Expansion, og<em> In vivo</em> Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)
Summary
Denne protokol beskriver udviklingen, ekspansion, og in vivo billeddannelse af NK-celler afledt fra hESCs og iPSCs.
Abstract
Vi præsenterer en metode til at udlede naturlige dræberceller (NK-celler) fra udifferentierede hESCs og iPSCs hjælp af en feeder-fri tilgang. Denne metode giver anledning til høje niveauer af NK-celler efter 4 ugers kultur og kan undergå yderligere 2-log ekspansion med kunstige antigenpræsenterende celler. hESC-og iPSC-afledte NK-celler udviklet i dette system har en moden fænotype og funktion. Produktionen af et stort antal genetisk modificerbare NK-celler er gældende for både grundforskning mekanistisk samt anti-tumor studier. Ekspression af ildflueluciferase i hESC-afledte NK-celler giver en non-invasiv metode til at følge NK-celle transplantation, distribution og funktion. Vi beskriver også en dual-imaging ordning, der giver mulighed for separat overvågning af to forskellige cellepopulationer til mere udpræget karakterisere deres interaktion in vivo. Denne metode til afledning, ekspansion, og dual in vivo imaging giver en pålidelig metode til at frembringe NK-celler, og deres evalueringtion, der er nødvendig for at forbedre de nuværende NK celle adoptivforældre behandlingsformer.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (iPSCs), er udifferentierede, pluripotente celler, som kan ubegrænset selvfornyelse og multi-slægt differentiering. hESCs succes er blevet differentieret i modne og funktionelle undergrupper af hver kim lag, herunder celler af den hæmatopoietiske system 1-3. Naturlige dræberceller (NK-celler) er lymfocytter i det medfødte immunsystem, der kan afledes af hESCs ved dannelse af embryoid organer (EBS) 4,5 eller co-kultur med stromale cellelinier 1,2,6-8. NK-celler besidder anti-viral og anti-tumor egenskaber og har potentiale til at være effektiv mod en bred vifte af maligniteter, da de ikke kræver forudgående antigenstimulering til at udføre deres effektorfunktioner. Således hESC afledt NK-celler er en attraktiv kilde til celler til immunterapi. Derudover afledning af NK-celler fra hESCs giver et genetisk medgørlige til undersøgelse normal udvikling <em> in vitro.
Fordi de giver et genetisk medgørligt system kan embryonale afledt NK celler eksperimentelt modificeret til at udtrykke fluorescerende og bioluminescerende reportere giver en optimal model til at studere NK celle effektorfunktioner in vitro og in vivo. hESC-afledte NK-celler besidder aktivitet mod en række mål, herunder HIV 9, leukæmi (K562) og andre kræfttyper 7,8. Men evnen effektivt udlede nok NK-celler er i stand til at behandle patienter fortsat en vigtig barriere for klinisk oversættelse og er i mindre grad, en begrænsning for omfattende prækliniske in vivo studier af NK-celle udvikling og anti-cancer-funktioner. Her bruger vi et spin EB tilgang til at udlede hæmatopoietiske stamfædre fra hESCs 4,5,10. Efter elleve dage spin EB overføres til NK-celle kultur med eller uden automater til 28 dage. Efter 4 uger i NK-celle dyrkningsmedium, er NK-celler transferred til co-kultur med K562-celler modificeret til at udtrykke membranbundet interleukin 21 (IL-21), der tjener som kunstige antigenpræsenterende celler (aAPCs). Tilpasning en protokol til udvidelse af perifert blod NK-celler ved hjælp af disse kunstige APC'er 11,12, vi er i stand til at udvide NK-celler 2-logs og samtidig bevare en moden fænotype og cytotoksiske kapaciteter.
Denne proces med udvikling og ekspansion giver tilstrækkelige embryonale afledt NK-celler til omfattende in vivo karakterisering. Til in vivo studier, er vi i stand til ikke-invasivt overvåge langsigtet engraftment og kinetik af indsprøjtet ildflueluciferase udtrykker (Fluc +), embryonale-afledte NK-celler ved hjælp af bioluminescens billeddannelse. Desuden er vi i stand til at følge NK celleinteraktioner med tumorceller ved hjælp af en dobbelt, selvlysende eller fluorescerende billeddannelse ordningen. En tidligere undersøgelse fra vores gruppe brugte bioluminescence billeddannelse i en anti-tumor model til efterfølgelse tumor progression og cleArance af udsving + K562-celler in vivo 7.. Nu ved ingeniør vore hESCs at udtrykke ildflueluciferase 13,14 vi kan følge biofordelingen og handel med NK-celler til K562 tumorceller, som udtrykker den nyligt karakteriseret fluorescerende protein, turboFP650 15.. Vi har valgt dette dobbelte reporter system for at samtidigt følge de to cellepopulationer in vivo (figur 1). De fleste dual imaging modeller har været dual-luciferase-systemer, men disse systemer kan teknisk udfordrende på grund af de levering krav coelenterazin, underlaget kræves for ekspression af de fleste Renilla og Gaussia luciferase journalister 16-18. Fluorescerende reportere har tilladt nem overvågning af mange cellelinjer og konstruktioner in vitro, men har haft begrænset succes til in vivo billeddannelse på grund af overlapning mellem væv og pels autofluorescens og emission spektre af mange commonly brugt fluorescerende reportere, herunder GFP, DsRed og TdTomato 15,19. Denne bekymring har tilskyndet til udviklingen af langt rødt fluorescerende proteiner, som tillader en bedre væv penetrans og højere specifik signal i forhold til baggrunden 15,19. TurboFP650 det fluorescerende protein er vist i dette system, er langt rødt flyttet og overvinder mange af de spørgsmål, der er forbundet med billeddiagnostiske fluorescerende proteiner i levende dyr.
Denne metode for udvikling og udvidelse NK-celler afledt fra hESCs har givet os mulighed for yderligere at karakterisere embryonale afledt NK-celler in vitro og in vivo, som er nødvendig for bedre at forstå NK-cellernes funktion og klinisk vigtigt at forbedre de nuværende NK celle adoptiv behandlingsformer. Det er også modtagelig for udledning og udvidelse af iPSC-afledte NK-celler. Den dobbelte fluorescerende og bioluminiscerende imaging-ordningen er bredt anvendelig til andre systemer end den anti-tumor model, vi har vist her.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs er en ideel platform til at studere diverse celletyper og holde bemærkelsesværdigt potentiale for klinisk oversættelse. Vi bruger en defineret, spin-EB tilgang til at differentiere embryonale / iPSCs til bloddannende stamceller. Spin EB tilgang har givet konsekvent afledning af hæmatopoietiske stamceller og differentiering til NK-celler endnu, variation, findes stadig i differentiering effektiviteten på tværs cellelinjer og skal muligvis modificeres til generering af andre hæmatopoietiske cellelinier. Mens …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Melinda Hexum til indvielse af spin EB-protokollen inden for vores lab. Vi vil gerne takke de øvrige medlemmer af laboratoriet, herunder Laura E. Bendzick, Michael Lepley og ZhenYa Ni for deres tekniske bistand med dette arbejde. Forfatterne vil også gerne takke Brad Taylor på Caliper Life Sciences for hans ekspert teknisk rådgivning.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
