विकास, विस्तार, और<em> विवो में</em> मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से मानव एन.के. कोशिकाओं की निगरानी और और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)
Summary
इस प्रोटोकॉल के विकास, विस्तार, और hESCs और iPSCs से व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के vivo इमेजिंग में वर्णन करता है.
Abstract
हम एक फीडर से मुक्त दृष्टिकोण का उपयोग undifferentiated hESCs और iPSCs से प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल) पाने के लिए एक तरीका मौजूद है. इस विधि 4 सप्ताह संस्कृति के बाद एन.के. कोशिकाओं के उच्च स्तर को जन्म देता है और कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं के साथ आगे 2 लॉग विस्तार से गुजरना कर सकते हैं. इस प्रणाली में विकसित hESC और iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को एक परिपक्व phenotype और समारोह है. आनुवंशिक रूप से परिवर्तनीय एन.के. कोशिकाओं की बड़ी संख्या का उत्पादन दोनों बुनियादी यंत्रवत के साथ ही विरोधी ट्यूमर के अध्ययन के लिए लागू है. HESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं में जुगनू luciferase की अभिव्यक्ति एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण एन.के. सेल engraftment, वितरण, और समारोह का पालन करने की अनुमति देता है. हम भी दो अलग सेल आबादी के अलग निगरानी और अधिक स्पष्ट vivo में उनकी बातचीत को अनुमति देता है कि एक दोहरे इमेजिंग योजना का वर्णन है. Vivo इमेजिंग में व्युत्पत्ति, विस्तार, और दोहरे का यह तरीका एक विश्वसनीय एन.के. कोशिकाओं के उत्पादन के लिए दृष्टिकोण और उनके evalu प्रदान करता हैवर्तमान एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के लिए आवश्यक है जो समझना.
Introduction
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) असीमित आत्म नवीकरण और बहु - वंश भेदभाव करने में सक्षम अविभाजित, pluripotent कोशिकाओं हैं. hESCs के सफलतापूर्वक 1-3 hematopoietic प्रणाली की कोशिकाओं सहित प्रत्येक रोगाणु परत की परिपक्व और कार्यात्मक कैंपेन्स, में भेदभाव किया गया है. प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल) stromal सेल लाइनों 1,2,6-8 साथ embryoid निकायों के गठन (ईबीएस) 4,5 या सह संस्कृति से hESCs से प्राप्त किया जा सकता है कि सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की लिम्फोसाइटों हैं. एन.के. कोशिकाओं विरोधी वायरल और विरोधी ट्यूमर क्षमताओं के अधिकारी और वे पहले प्रतिजन उत्तेजना उनके प्रेरक कार्यों का निष्पादन करने की आवश्यकता नहीं है, के रूप में दुर्दमताओं का एक व्यापक रेंज के खिलाफ प्रभावी होने की संभावना है. इस प्रकार, hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं immunotherapy के लिए कोशिकाओं का एक आकर्षक स्रोत हैं. इसके अतिरिक्त, hESCs से एन.के. कोशिकाओं की व्युत्पत्ति सामान्य विकास का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से उत्तरदायी प्रणाली प्रदान करता है <उन्हें> इन विट्रो में.
वे एक आनुवंशिक विनयशील प्रणाली प्रदान करते हैं, hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं प्रयोगात्मक इन विट्रो और इन विवो में एन.के. सेल प्रेरक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम मॉडल उपलब्ध कराने फ्लोरोसेंट और bioluminescent पत्रकारों को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को एचआईवी 9, ल्यूकेमिया (K562) और अन्य प्रकार के कैंसर 7,8 सहित लक्ष्यों की एक श्रृंखला के खिलाफ गतिविधि के अधिकारी. हालांकि, क्षमता कुशलता से एक डिग्री कम है, एन.के. सेल विकास और कैंसर विरोधी कार्यों के vivo अध्ययन में व्यापक पूर्व नैदानिक के लिए एक सीमा तक, इलाज के रोगियों में सक्षम पर्याप्त एन.के. कोशिकाओं नैदानिक अनुवाद के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है और प्राप्त करने के लिए. यहाँ, हम hESCs 4,5,10 से hematopoietic पूर्वज प्राप्त करने के लिए एक स्पिन ईबी दृष्टिकोण का उपयोग करें. 11 दिनों के बाद स्पिन ईबीएस 28 दिनों के लिए फीडरों के साथ या बिना एन.के. सेल संस्कृति के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. एन.के. सेल संस्कृति माध्यम में 4 हफ्तों के बाद, एन.के. कोशिकाओं ट्रॅन हैंकृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPCs) के रूप में सेवा करते हैं जो झिल्ली ही सीमित इंटरल्यूकिन 21 (आईएल -21), व्यक्त करने के लिए संशोधित K562 कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति को sferred. इन कृत्रिम APCs 11,12 उपयोग कर परिधीय रक्त एन.के. कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल आदत डाल, हम एक परिपक्व phenotype और साइटोटोक्सिक क्षमताओं को बनाए रखते हुए एन.के. कोशिकाओं 2 लॉग का विस्तार करने में सक्षम हैं.
विकास और विस्तार की यह प्रक्रिया विवो लक्षण वर्णन में व्यापक लिए पर्याप्त hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं प्रदान करता है. Vivo अध्ययन में, हम व्यक्त गैर invasively इंजेक्शन जुगनू luciferase की दीर्घकालिक engraftment और कैनेटीक्स निगरानी करने में सक्षम हैं (Fluc +) bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं. इसके अलावा, हम एक दोहरी, bioluminescent या फ्लोरोसेंट इमेजिंग योजना का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एन.के. सेल बातचीत का पालन करने में सक्षम हैं. हमारे समूह से पहले के एक अध्ययन ट्यूमर प्रगति और cle के पालन करने के लिए एक विरोधी ट्यूमर मॉडल में bioluminescence इमेजिंग का इस्तेमाल कियाविवो 7 में Fluc + K562 कोशिकाओं की Arance. अब, एक्सप्रेस जुगनू luciferase 13,14 को हमारे hESCs के इंजीनियरिंग द्वारा हम हाल ही में विशेषता फ्लोरोसेंट प्रोटीन, turboFP650 15 व्यक्त कि K562 ट्यूमर कोशिकाओं को एन.के. कोशिकाओं के biodistribution और तस्करी का पालन कर सकते हैं. हम एक साथ vivo में दो सेल आबादी (चित्रा 1) का पालन करने के लिए इस दोहरी संवाददाता प्रणाली को चुना है. हाल दोहरी इमेजिंग मॉडल दोहरे luciferase सिस्टम दिया गया है, लेकिन इन प्रणालियों के तकनीकी कारण coelenterazine का वितरण आवश्यकताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, सब्सट्रेट सबसे Renilla और Gaussia luciferase पत्रकारों 16-18 की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है. फ्लोरोसेंट संवाददाताओं कई सेल लाइनों और इन विट्रो में निर्माणों की आसान निगरानी की अनुमति दी है, लेकिन कारण ऊतक और फर autofluorescence और कई सह के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच ओवरलैप करने के लिए vivo इमेजिंग में सीमित सफलता मिली हैmmonly GFP, dsRed, और tdTomato 15,19 सहित फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से इस्तेमाल किया. यह चिंता का विषय है बेहतर ऊतक अंतर्वेधन और पृष्ठभूमि 15,19 की तुलना में अधिक विशिष्ट संकेत के लिए अनुमति देते हैं जो दूर तक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विकास को प्रोत्साहित किया है. TurboFP650, इस प्रणाली में दिखाया फ्लोरोसेंट प्रोटीन, दूर लाल स्थानांतरित कर दिया है और रहने वाले जानवरों में इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े मुद्दों के कई काबू.
HESCs से व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के विकास और विस्तार के लिए इस विधि हमें आगे इन विट्रो में और बेहतर मौजूदा एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के एन.के. सेल समारोह और नैदानिक महत्वपूर्ण समझ लेना जरूरी है, जो इन विवो में hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए अनुमति दी गई है. यह भी व्युत्पत्ति और iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उत्तरदायी है. दोहरी फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग योजना हम यहाँ से पता चला है विरोधी ट्यूमर मॉडल की तुलना में अन्य प्रणालियों के लिए मोटे तौर पर लागू है.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन और नैदानिक अनुवाद के लिए उल्लेखनीय संभावित पकड़ के लिए एक आदर्श मंच है. हम hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को hESC / iPSCs अंतर करने के लिए एक परिभाषित, स्पिन ईबी दृष्ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों हमारी प्रयोगशाला के भीतर स्पिन ईबी प्रोटोकॉल की दीक्षा के लिए मेलिंडा Hexum धन्यवाद देना चाहूंगा. हम लौरा ई. Bendzick, माइकल Lepley, और इस काम के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए Zhenya नी सहित प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों को भी अपने विशेषज्ञ तकनीकी सलाह के लिए कैलिपर लाइफ साइंसेज में ब्रैड टेलर को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
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