Detta protokoll beskriver utveckling, expansion och in vivo-avbildning av NK-celler härledda från hESCs och iPSCs.
Vi presenterar en metod för att härleda naturliga mördarceller (NK) celler från odifferentierade hESCs och iPSCs med en feeder-fri tillvägagångssätt. Denna metod ger upphov till höga nivåer av NK-celler efter fyra veckors odling och kan genomgå ytterligare två-log expansion med artificiella antigenpresenterande celler. hESC-och iPSC-härledda NK-celler som utvecklats i detta system har en mogen fenotyp och funktion. Produktionen av ett stort antal genetiskt modifierbara NK-celler är tillämplig för både grundläggande mekanistiska samt anti-tumör studier. Uttryck av eldflugeluciferas i hESC härledda-NK-celler gör att en icke-invasiv metod för att följa NK cell engraftment, distribution och funktion. Vi beskriver också en dual-imaging system som möjliggör separat kontroll av två olika cellpopulationer att tydligare beskriva deras interaktioner in vivo. Denna metod för härledning, expansion, och dual in vivo imaging ger en tillförlitlig metod för att producera NK-celler och deras utvärdeation som är nödvändig för att förbättra nuvarande NK cell adoptiv terapier.
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är odifferentierade, pluripotenta celler som kan obegränsat självförnyelse och flera härstamning differentiering. hESCs har framgångsrikt differentieras till mogna och funktionella undergrupper av varje GRODDBLAD, inklusive celler i hematopoetiska systemet 1-3. Naturliga mördarceller (NK) celler är lymfocyter i det medfödda immunförsvaret som kan härledas från hESCs genom bildning av embryoidkroppar (EBS) 4,5 eller samodling med stromacellinjer 1,2,6-8. NK-celler har anti-virala och anti-tumör kapacitet och har potential att vara effektiva mot ett brett område av maligniteter, eftersom de inte kräver tidigare antigen stimulering för att utföra sina effektorfunktioner. Således hESC-derived NK-celler är en attraktiv källa till celler för immunterapi. Dessutom ger härledningen av NK-celler från hESCs ett genetiskt mottaglig system för att studera normal utveckling <em> in vitro.
Eftersom de ger en genetiskt foglig system kan hESC-derived NK-celler experimentellt modifieras för att uttrycka fluorescerande och bioluminescerande reportrar ger en optimal modell för att studera NK cell effektorfunktioner in vitro och in vivo. hESC-härledda NK-celler uppvisar aktivitet mot en rad mål inklusive HIV 9, leukemi (K562) och andra typer cancer 7,8. Men förmågan härleda tillräckligt effektivt NK-celler med förmåga att behandla patienter förblir ett viktigt hinder för klinisk översättning och är, i mindre grad, en begränsning för omfattande prekliniska in vivo-studier av NK-cell utveckling och anti-cancer-funktioner. Här använder vi en metod spin EB att härleda hematopoetiska stamceller från hESCs 4,5,10. Efter 11 dagar av spin EB överförs till NK-cell kultur med eller utan matare för 28 dagar. Efter 4 veckor i NK cellodlingsmedium, NK-celler är transferred till samodling med K562-celler modifierade för att uttrycka membranbundna interleukin 21 (IL-21), som fungerar som konstgjorda antigenpresenterande celler (aAPCs). Att anpassa ett protokoll för utbyggnaden av perifert blod NK-celler med dessa artificiella APC 11,12, kan vi utöka NK-celler 2-stockar och samtidigt behålla en mogen fenotyp och cytotoxiska kapacitet.
Denna process av utveckling och expansion ger tillräckliga hESC-derived NK-celler för omfattande in vivo karakterisering. För in vivo-studier, har vi möjlighet att icke-invasivt övervaka långsiktigt engraftment och kinetik av injiceread eldflugeluciferas som uttrycker (Fluc +), hESC-derived NK-celler med hjälp av bioluminescens avbildning. Dessutom har vi möjlighet att följa NK cell interaktioner med tumörceller med en dubbel, bioluminiscent eller fluorescerande imaging system. En tidigare studie från vår grupp används mareld avbildning i en anti-tumör modell att följa tumörprogression och cleArance av Fluc + K562-celler in vivo 7. Nu, genom att iscensätta våra hESCs att uttrycka eldflugeluciferas 13,14 vi kan följa biofördelningen och trafficking av NK-celler till K562 tumörceller som uttrycker sistone präglats fluorescerande protein, turboFP650 15. Vi har valt detta dubbla reportersystem för att samtidigt följa de två cellpopulationer in vivo (Figur 1). Mest dubbla imaging modeller har dual-luciferasenheter system, men dessa system kan tekniskt utmanande på grund av leveranskrav för coelenterazin, underlaget som krävs för uttryck av de flesta Renilla och Gaussia luciferas reportrar 16-18. Fluorescerande reportrar har tillåtit enkel övervakning av många cellinjer och konstruktioner in vitro, men har haft begränsad framgång för in vivo imaging grund av överlappningen mellan vävnad och päls autofluorescens och emissionsspektra för många commonly används fluorescerande reportrar inkluderande GFP, DsRed, och tdTomato 15,19. Denna oro har uppmuntrat utvecklingen av långt-röda fluorescerande proteiner, som möjliggör bättre vävnad penetrans och högre specifik signal jämfört med bakgrunden 15,19. TurboFP650, det fluorescerande proteinet som visas i detta system är långt-rött skiftat och övervinner många av de frågor som med avbildning fluorescerande proteiner i levande djur.
Denna metod för att utveckla och expandera NK-celler som härrör från hESCs har tillåtit oss att ytterligare karakterisera hESC-derived NK-celler in vitro och in vivo, vilket är nödvändigt för att bättre förstå NK cellernas funktion och kliniskt viktigt att förbättra nuvarande NK cell adoptiv terapier. Det är också mottaglig för härledning och expansionen av iPSC-härledde NK-celler. Den dubbla lysrör och självlysande avbildning system är brett tillämpbar för andra system än den anti-tumör modell vi har visat här.
hESCs är en idealisk plattform för att studera olika celltyper och håller anmärkningsvärd potential för klinisk översättning. Vi använder ett definierat, spin EB strategi att differentiera hESC / iPSCs till hematopoetiska stamceller. Den spin EB metoden har gett konsekvent härledning av hematopoetiska stamceller och differentiering för att NK-celler, men, variation fortfarande existerar i differentiering effektivitet inom cellinjer och kan behöva modifieras för generering av andra hematopoetiska cellinjer. …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Melinda Hexum för initiering av spin EB protokoll inom vårt labb. Vi vill tacka övriga medlemmar i labbet, däribland Laura E. Bendzick, Michael Lepley och ZhenYa Ni för sitt tekniska bistånd med detta arbete. Författarna vill också tacka Brad Taylor på Caliper Life Sciences för hans sakkunnig teknisk rådgivning.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Media | |||
BPEL media for Spin EB generation | |||
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
NK Differentiation Media | |||
Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
Cytokines | |||
(all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
In vivo Imaging | |||
D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
Equipment | |||
IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
Cells | |||
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.