A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم
Summary
لقد قمنا بتطوير زراعة الخلايا الآلي ومنصة الاستجواب للتجارب التحفيز الخلية الصغيرة الحجم. منصة يوفر تحكم بسيطة، وتنوعا، ودقيق في زراعة وتحفيز المجموعات الصغيرة من الخلايا، واستعادة لست] للالتحليلات الجزيئية. منصة هي مناسبة تماما للدراسات التي تستخدم الخلايا الثمينة و / أو الكواشف.
Abstract
وقد وفرت دراسة الخلايا في الثقافة (في تحليل المختبر) نظرة متبصرة في النظم البيولوجية المعقدة. الأساليب التقليدية والمعدات اللازمة لفي تحليل المختبر هي مناسبة تماما لدراسة أعداد كبيرة من الخلايا (≥ 10 5) في مجلدات على نطاق وملليلتر (≥ 0.1 مل). ومع ذلك، هناك العديد من الحالات التي كان من الضروري أو المرغوب فيه إلى تقليص حجم الثقافة للحد من استهلاك الخلايا من الفائدة و / أو الكواشف اللازمة لثقافتهم، والتحفيز، أو المعالجة. للأسف، والنهج التقليدي لا تدعم التلاعب دقيقة وقابلة للتكرار من الثقافات الصغيرة الحجم، والنظم الآلية القائمة على على microfluidics المتوفرة حاليا هي معقدة جدا ومتخصصة للاستخدام الروتيني من قبل معظم المختبرات. لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير منصة تقنية بسيطة وتنوعا للثقافة الآلي، والتحفيز، واستعادة مجموعات صغيرة من الخلايا (100 – 2،000 الخلايا) في حجم الصغيرة الحجمق (1-20 ميكرولتر). تتكون منصة لمجموعة من فبرونيكتين المغلفة microcapillaries ("غرف نضح الخلية")، التي وضعت ضمن الثقافات الصغيرة الحجم، حافظ، وحفز؛ وعلى microfluidics (DMF) جهاز رقمي تجهيزه مع "نقل" microcapillaries ("المحور المركزي ")، التي المسارات الخلايا والكواشف من وإلى غرف نضح؛ مضخة محقنة عالية الدقة، والذي نقل صلاحيات المواد بين الغرف نضح والمحور المركزي؛ وواجهة الإلكترونية التي توفر السيطرة على نقل المواد، والتي هي منسقة والآلي عبر البرامج النصية محددة سلفا. وكمثال على ذلك، استخدمنا منصة لتسهيل دراسة استجابات النسخي أثارت في الخلايا المناعية على التحدي مع البكتيريا. استخدام منصة مكنتنا من تقليل استهلاك الخلايا والكواشف، وتقليل التباين التجربة إلى التجربة، وإعادة توجيه التدريب العملي على العمل. وبالنظر إلى المزايا التي تمنح، وكذلك في إمكانية الوصول والتنوع، سمنصة اور ينبغي أن تجد استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المختبرات والتطبيقات، وتكون مفيدة خاصة في تسهيل تحليل الخلايا والمحفزات التي تتوفر بكميات محدودة فقط.
Introduction
وقد وفرت دراسة خلايا المحافظة في الثقافة (في تحليل المختبر) نظرة لا تقدر بثمن في المبادئ الأساسية والآليات الجزيئية التي تحكم النظم البيولوجية المعقدة وصحة الإنسان. تم تصميم الطرق التقليدية للثقافة، والتحفيز، ومجموعة من الخلايا لتحليلها، التي تستخدم أطباق بتري ووحات microtiter، لدراسة أعداد كبيرة من الخلايا (≥ 10 5) في مجلدات الثقافة على نطاق وملليلتر (≥ 0.1 مل). ومع ذلك، هناك العديد من الحالات التي ليست سوى كميات محدودة من الخلايا المتاحة (مثل الخلايا الأولية)، أو المجموعات الصغيرة من الخلايا المرغوب فيه (على سبيل المثال للحد من خلية الى خلية تقلب عبر السكان)، أو الكواشف المطلوبة يصعب الحصول عليها أو باهظة التكاليف (مثل تنقية العوامل الخلية يفرز). مثل هذه القضايا لا يمكن معالجتها بنجاح من قبل تقليص حجم والثقافة، والتي لها فائدة إضافية تتمثل في خفض استهلاك جميعالكواشف اللازمة للتحليل في المختبر 1،2. للأسف، المعدات والأساليب التقليدية لا تعتمد التلاعب دقيقة وقابلة للتكرار من الثقافات الصغيرة الحجم والنظم الآلية القائمة على على microfluidics المتاحة حاليا 3-11 معقدة جدا ومتخصصة للاستخدام الروتيني من قبل معظم المختبرات.
في هذا التقرير، وصفنا التجمع واستخدام منصة تكنولوجيا بسيطة وتنوعا للثقافة الآلي، والتحفيز، واستعادة مجموعات صغيرة من الخلايا (100 – 2،000 الخلايا) في أحجام الصغيرة الحجم (1-20 ميكرولتر). بنية منصة (الشكل 1) هي وحدات مستقلة في تصميم: مجموعة من فبرونيكتين المغلفة microcapillaries ("غرف نضح الخلية" وحدة نمطية) يخدم كموقع لإنشاء، والصيانة، والتحفيز من الثقافات على نطاق والجزئي؛ وعلى microfluidics الرقمية (DMF ) 12،13 الجهاز تجهيزه مع "نقل" microcapillaries ("المحور المركزي" وحدة نمطية) 14،15 المسارات الخلاياوالكواشف من وإلى غرف نضح. DMF تمكن المستخدم من معالجة فردي قطرات متعددة في نفس الوقت وإلى تغيير أو إعادة ترتيب التلاعب (أي إعادة تكوين نموذج القطارات التجهيز) دون تغيير الأجهزة الجهاز. لها مرونة هائلة هو واضح في ظهور في الآونة الأخيرة باعتباره التكنولوجيا الرئيسية في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الثقافة خلية 16،17، المقايسات انزيم 18،19، 20،21 المناعية، وتحليل الحمض النووي 22،23، وتجهيز بروتين، 24،25 وتجهيز العينات السريرية. 26،27 محور مركزي لدينا يستفيد من المرونة الملازمة لأجهزة DMF، وكذلك يعزز ذلك من خلال إضافة واجهات microcapillary، الذي يوفر فرصة لتنفيذ مجموعة فرعية من التلاعب (مثل زراعة الخلايا) في الطرفية المتخصصة وحدات، وليس على جهاز DMF نفسها. تجزئة وحدات لمعالجة بهذه الطريقة أيضا يبسط تصميم جيش التحرير الشعبى الصينىtform العمارة (لا حاجة لبناء جهاز DMF التي يمكن تنفيذ جميع خطوات التجهيز) ويسهل تطورها، وظائف جديدة مطلوبة (ببساطة دمج وحدات طرفية جديدة حسب الضرورة). هو الدافع وراء نقل الخلايا والكواشف داخل محور مركزي من قبل electrowetting القوات التي تولدها تفعيل متتابعة من الأقطاب الكهربائية داخل الجهاز DMF 13،28؛ النقل من وإلى وداخل غرف نضح هو مدعوم من وتغيرات الضغط الناتجة عن حقنة عالية الدقة مضخة. يتم التحكم في جميع هذه الحركات السوائل عبر واجهة إلكترونية بسيطة ومؤتمتة من خلال استخدام البرامج النصية محددة سلفا.
كمثال ممثل، ونحن لشرح استخدام منصة لدراسة استجابات النسخي أثارت في الخلايا المناعية على التحدي مع البكتيريا (الشكل 2). تنفيذ هذه التجارب على منصة مكنتنا من العمل مع أعداد صغيرة من الخلايا (~ 1،000 في التجربهحالة TAL)، تقليل التباين التجربة إلى التجربة، الكواشف الحفاظ، وإعادة توجيه التدريب العملي على العمل. وبالنظر إلى المزايا التي تمنح، وكذلك في إمكانية الوصول والتنوع، ينبغي أن هذا المنبر تجد استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المختبرات والتطبيقات وتكون مفيدة خاصة في تسهيل تحليل الخلايا والمحفزات التي تتوفر بكميات محدودة فقط.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتطوير منصة بسيطة وتنوعا الآلي للثقافة الخلية الصغيرة الحجم والتجارب التحفيز. منصة تمكننا من العمل مع وحدات التخزين الصغيرة وثقافة السكان الخلية (1-20 ميكرولتر و 100 – 2،000 خلايا، لكل غرفة)؛ الأحجام ثقافة يمكن تخفيض أكبر من خلال استخدام microcapillaries من قطر أصغر….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفان بالشكر رونالد F. رينزي ومايكل S. بارتش لمساهماتها في مجال تصميم وتطوير أجهزة DMF والمحور DMF. وأيد هذا البحث بالكامل من قبل مختبر إخراج برنامج البحوث والتنمية في مختبرات سانديا الوطنية. سانديا هو مختبر برنامج متعدد إدارتها وتشغيلها من قبل شركة سانديا، وهي شركة تابعة مملوكة بالكامل لشركة لوكهيد مارتن كوربوريشن، عن وزارة الخارجية الأمريكية في إدارة الأمن النووي الوطنية للطاقة بموجب عقد DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry – Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
