Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire
Summary
Nous avons développé une culture de cellules automatisé et plate-forme d'interrogation pour les expériences de stimulation cellulaire micro-échelle. La plate-forme offre un contrôle simple, polyvalent et précis dans la culture et la stimulation de petites populations de cellules, et la récupération de lysats pour les analyses moléculaires. La plate-forme est bien adapté aux études qui utilisent des cellules précieux et / ou des réactifs.
Abstract
Étude des cellules en culture (analyse in vitro) a fourni des informations importantes sur les systèmes biologiques complexes. Méthodes et équipements conventionnels pour analyse in vitro sont bien adaptés à l'étude d'un grand nombre de cellules (≥ 10 5) des volumes millilitre échelle (≥ 0,1 ml). Cependant, il ya de nombreux cas dans lesquels il est nécessaire ou souhaitable de réduire la taille de la culture pour réduire la consommation des cellules d'intérêt et / ou de réactifs nécessaires à leur culture, stimulation, ou de transformation. Malheureusement, les approches conventionnelles ne supportent pas une manipulation précise et reproductible des cultures de micro-échelle, et les systèmes automatisés microfluidique à base actuellement disponibles sont trop complexes et spécialisés pour une utilisation de routine par la plupart des laboratoires. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une plate-forme technologique simple et polyvalent pour la culture automatisé, la stimulation et la récupération de petites populations de cellules (100 – 2.000 cellules) en volume à micro-échelles (1 – 20 pi). La plate-forme se compose d'un ensemble de microcapillaires revêtues de fibronectine («chambres de perfusion de cellules"), dans lequel les cultures de micro-échelle sont établis, maintenus et encouragés; un appareil numérique microfluidique (DMF) équipé de «transfert» microcapillaires ("hub central "), dont les cellules itinéraires et des réactifs vers et à partir des chambres de perfusion; une pompe à seringue à haute précision, qui transportent des puissances de matériaux entre les chambres de perfusion et le moyeu central, et une interface électronique qui permet de contrôler le transport de matières, ce qui est coordonné et automatisé via des scripts préétablis. À titre d'exemple, nous avons utilisé la plate-forme pour faciliter l'étude des réactions suscitées transcription dans les cellules immunitaires lors de défi avec des bactéries. L'utilisation de la plate-forme nous a permis de réduire la consommation de cellules et de réactifs, de minimiser la variabilité expérience à l'expérience, et de réorienter les mains sur le travail. Compte tenu des avantages qu'il confère, ainsi que son accessibilité et sa polyvalence, our plate-forme doit trouver une utilisation dans une grande variété de laboratoires et d'applications, et se révéler particulièrement utile pour faciliter l'analyse des cellules et des stimuli qui sont disponibles en quantités limitées.
Introduction
L'étude des cellules maintenues en culture (analyse in vitro) a fourni de précieuses informations sur les principes fondamentaux et les mécanismes moléculaires qui régissent les systèmes biologiques complexes et la santé humaine. Les méthodes conventionnelles de culture, la stimulation et la collecte de cellules d'analyse, qui utilisent des boîtes de Pétri et les plaques de microtitration, ont été conçus pour l'étude de grandes populations de cellules (≥ 10 5) dans des volumes de culture millilitre échelle (≥ 0,1 ml). Cependant, il existe de nombreux cas où des quantités limitées de cellules sont disponibles (par exemple des cellules primaires), ou de petites populations de cellules sont souhaitables (par exemple pour réduire la variabilité de cellule à cellule dans la population), ou réactifs nécessaires sont difficiles à obtenir ou trop coûteux (par exemple les facteurs cellulaires sécrétées purifiées). Ces problèmes peuvent être résolus avec succès par révision à la baisse la taille de la culture, qui a l'avantage supplémentaire de réduire la consommation de tous lesréactifs nécessaires à l'analyse 1,2 vitro. Malheureusement, le matériel et les méthodes conventionnelles ne supportent pas une manipulation précise et reproductible des cultures de micro-échelle et les systèmes automatisés microfluidique à base actuellement disponibles 3-11 sont trop complexes et spécialisés pour une utilisation de routine par la plupart des laboratoires.
Dans ce rapport, nous décrivons l'assemblage et l'utilisation d'une plate-forme technologique simple et polyvalent pour la culture automatisé, la stimulation et la récupération de petites populations de cellules (100 – 2.000 cellules) dans des volumes micro-échelle (1 – 20 pi). L'architecture de la plate-forme (figure 1) est de conception modulaire: un ensemble de fibronectine revêtu microcapillaires («chambres de perfusion de cellules" du module) sert de site pour l'établissement, l'entretien et la stimulation des cultures de micro-échelle et une microfluidique numérique (DMF ) 12,13 appareil équipé de "transfert" microcapillaires (module "central hub") 14,15 Cellules itinéraireset des réactifs vers et à partir des chambres de perfusion. DMF permet à l'utilisateur de régler individuellement plusieurs gouttelettes simultanément et modifier ou réorganiser les manipulations (c. trains de traitement des échantillons de reconfigurer) sans altérer le matériel de l'appareil. Sa grande flexibilité est évidente dans sa récente apparition comme une technologie clé dans un large éventail d'applications, y compris la culture de cellules 16,17, 18,19 dosages enzymatiques, immunologiques 20,21, 22,23 analyse de l'ADN, la transformation des protéines, 24,25 et le traitement des échantillons cliniques. 26,27 Notre hub central tire parti de la flexibilité inhérente aux dispositifs DMF, et améliore encore ce grâce à l'ajout d'interfaces microcapillaires, qui offre la possibilité de réaliser un sous-ensemble de manipulations (par exemple, la culture de cellules) dans les zones périphériques spécialisés modules, plutôt que sur l'appareil lui-même DMF. Cloisonnement des trains de traitement de cette manière simplifie également la conception de l'APLtform architecture (pas besoin de construire un dispositif de DMF qui peut effectuer toutes les étapes de transformation) et facilite son évolution en tant que de nouvelles fonctions sont nécessaires (il suffit d'intégrer de nouveaux modules périphériques que nécessaire). Transport des cellules et des réactifs à l'intérieur du moyeu central est entraîné par électromouillage forces engendrées par l'activation séquentielle des électrodes à l'intérieur du dispositif DMF 13,28, le transport à destination, et à l'intérieur des chambres de perfusion est effectuée par des changements de pression générés par une seringue à haute précision pompe. Tous ces mouvements fluides sont contrôlés via une interface électronique simple et automatisée grâce à l'utilisation de scripts préétablis.
Comme un exemple représentatif, nous démontrons l'utilisation de la plate-forme pour l'étude des réponses transcriptionnelles suscité dans les cellules immunitaires à défi avec des bactéries (Figure 2). La réalisation de ces expériences sur la plate-forme nous a permis de travailler avec de petits nombres de cellules (~ 1000 par expérimentationétat mental), minimiser la variabilité expérience à l'expérience, les réactifs de conserver et re-direct-mains sur le travail. Compte tenu des avantages qu'il confère, ainsi que son accessibilité et polyvalence, cette plate-forme devrait trouver une utilisation dans une grande variété de laboratoires et d'applications et se révéler particulièrement utile pour faciliter l'analyse des cellules et des stimuli qui sont disponibles en quantités limitées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé une plate-forme automatisée simple et polyvalent pour la culture cellulaire à micro-échelle et des expériences de stimulation. La plate-forme nous permet de travailler avec de petits volumes de culture et les populations cellulaires (1 – 20 pi et 100 – 2.000 cellules, par chambre); dimensions de la culture pourrait être encore réduit par l'utilisation de micro-capillaires de petit diamètre. Travailler à ces échelles de réduire le coût des études de routine et fait des étu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Ronald F. Renzi et Michael S. Bartsch pour leur contribution à la conception et au développement de dispositifs DMF et le moyeu DMF. Cette recherche a été entièrement pris en charge par le Laboratoire de recherche en scène et le programme de développement au Sandia National Laboratories. Sandia est un laboratoire multi-programme géré et exploité par Sandia Corporation, une filiale en propriété exclusive de Lockheed Martin Corporation, pour le ministère de l'Administration nationale de sécurité nucléaire américain de l'Énergie sous contrat DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
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