We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.
Studie van cellen in kweek (in vitro analyse) heeft verstrekt belangrijk inzicht in complexe biologische systemen. Gebruikelijke werkwijzen en apparatuur voor in vitro analyses zijn zeer geschikt voor onderzoek van grote aantallen cellen (≥ 10 5) in milliliter volumes schaal (≥ 0,1 ml). Er zijn vele gevallen waarin het nodig of wenselijk om de schaal van cultuur maat om het verbruik van de cellen van belang en / of reagentia die nodig zijn voor hun cultuur, stimulatie of verwerking te verminderen. Helaas, conventionele benaderingen ondersteunen geen nauwkeurige en reproduceerbare manipulatie van micro-schaal culturen, en de microfluidics-based geautomatiseerde systemen die momenteel beschikbaar zijn te complex en gespecialiseerd voor routinematig gebruik door de meeste laboratoria. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een eenvoudige en veelzijdige technologieplatform ontwikkeld voor het geautomatiseerd cultuur, stimulatie, en het herstel van kleine populaties van cellen (100 – 2000 cellen) in micro-schaal volumes (1-20 pi). Het platform omvat een set van fibronectine gecoate microcapillairen ("cell perfusiekamers"), waarin micro-schaal kweken opstellen, handhaven en gestimuleerd, een digitale microfluidics (DMF) apparaat uitgerust met een "overdracht" microcapillairen ("central hub "), welke routes cellen en reagentia en naar de perfusiekamers, een hoge precisie spuitpomp, welke bevoegdheden transport van materialen tussen de perfusiekamers en de centrale naaf, en een elektronische schakeling die de controle over vervoer van materiaal bepaalt welke gecoördineerd en geautomatiseerd via vooraf bepaalde scripts. Als voorbeeld gebruikten we het platform om het onderzoek transcriptionele respons uitgelokt in immune cellen na challenge met bacteriën vergemakkelijken. Gebruik van het platform konden we het verbruik van cellen en reagentia te verminderen, te minimaliseren experiment-to-experiment variabiliteit, en re-direct hands-on arbeid. Gezien de voordelen die het verleent, alsook de toegankelijkheid en veelzijdigheid, our platform moet gebruik vinden in diverse laboratoria en toepassingen en vooral nuttig zijn bij het vergemakkelijken analyse van cellen en stimuli die slechts in beperkte hoeveelheden.
De studie van cellen in kweek (in vitro analyse) heeft verstrekt waardevol inzicht in de fundamentele principes en moleculaire mechanismen die complexe biologische systemen en de volksgezondheid. De conventionele methoden voor cultuur, stimulatie, en het verzamelen van cellen voor analyse, die petrischaaltjes en microtiterplaten benutten, zijn ontworpen voor onderzoek van grote populaties van cellen (≥ 10 5) in milliliter-schaal cultuur volumes (≥ 0,1 ml). Er zijn echter veel gevallen waarin slechts beperkte hoeveelheden cellen beschikbaar zijn (primaire cellen) of kleine populaties van cellen gewenst (bijv. cel-cel variabiliteit te verminderen in de populatie) of vereiste reagentia moeilijk te verkrijgen zijn of onbetaalbaar (bijv. gezuiverd cel-uitgescheiden factoren). Dergelijke kwesties met succes kan worden aangepakt door schaalverkleining cultuur grootte, die het extra voordeel van het verminderen van het verbruik van alle heeftbenodigde reagentia in vitro analyse 1,2. Helaas, conventionele apparatuur en methoden niet ondersteunen nauwkeurige en reproduceerbare manipulatie van micro-schaal culturen en de microfluidics-based geautomatiseerde systemen die momenteel beschikbaar 3-11 zijn te complex en gespecialiseerd voor routinematig gebruik door de meeste laboratoria.
In dit rapport beschrijven we de montage en het gebruik van een eenvoudige en veelzijdige technologie platform voor geautomatiseerde cultuur, stimulatie, en het herstel van kleine populaties van cellen (100 – 2000 cellen) in micro-schaal volumes (1-20 pi). Het platform architectuur (figuur 1) is modulair opgebouwd: een set van fibronectine gecoate microcapillairen ("cell perfusiekamers" module) fungeert als de plaats voor vestiging, de handhaving en stimulering van micro-schaal culturen, en een digitale microfluidics (DMF ) 12,13 apparaat uitgerust met een "transfer" microcapillairen ("centrale hub" module) 14,15 routes cellenen reagentia en naar de perfusiekamers. DMF kan de gebruiker individueel meerdere druppels tegelijk te pakken en de manipulaties (dwz herconfigureren monster verwerking treinen) te wijzigen of opnieuw te bestellen zonder de hardware-apparaat. Haar enorme flexibiliteit is duidelijk in zijn recente opkomst als een belangrijke technologie in een brede waaier van toepassingen, met inbegrip van celkweek 16,17, enzymassays 18,19, immunoassays 20,21, DNA-analyse 22,23, eiwit verwerking, 24,25 en klinisch monster verwerking. 26,27 Onze centrale hub maakt gebruik van de flexibiliteit die inherent zijn aan DMF apparaten, en verder verbetert het door de toevoeging van microcapillaire interfaces, die gelegenheid voor het uitvoeren van een subset van de manipulaties (bijvoorbeeld celkweek) in gespecialiseerde perifere biedt modules en niet op het apparaat zelf DMF. Compartimentering van de verwerking treinen op deze manier vereenvoudigt ook het ontwerp van de plaTForm architectuur (niet nodig om een DMF apparaat dat kan uitvoeren van alle processtappen te bouwen) en faciliteert de ontwikkeling daarvan als nieuwe functies zijn nodig (gewoon nieuwe perifere modules als nodig te integreren). Vervoer van cellen en reagentia in de centrale naaf wordt door electrowetting krachten opgewekt door sequentiële activering van elektroden in het apparaat DMF 13,28, transport naar, van en binnen de perfusiekamers wordt aangedreven door drukveranderingen opgewekt door een zeer nauwkeurige spuit pomp. Al deze vloeiende bewegingen worden via een eenvoudige elektronische interface en geautomatiseerd door het gebruik van vooraf bepaalde scripts.
Als representatief voorbeeld demonstreren we het gebruik van het platform voor de studie van transcriptionele respons uitgelokt in immune cellen na challenge met bacteriën (Figuur 2). Het uitvoeren van deze experimenten op het platform konden wij werken met kleine aantallen cellen (~ 1000 per experimenteletal conditie), het minimaliseren van experiment-to-experiment variabiliteit, behouden reagentia, en re-direct hands-on arbeid. Gezien de voordelen die het verleent, alsook de toegankelijkheid en veelzijdigheid, moet dit platform toepassing vinden in diverse laboratoria en toepassingen en vooral nuttig zijn bij het vergemakkelijken analyse van cellen en stimuli die slechts in beperkte hoeveelheden.
We hebben een eenvoudige en veelzijdige geautomatiseerd platform voor micro-schaal celcultuur en stimulatie experimenten ontwikkeld. Het platform stelt ons in staat om te werken met kleine volumes cultuur en celpopulaties (1 – 20 pl en 100 – 2000 cellen, per kamer); cultuur maten kan verder worden verminderd door gebruik te maken van microcapillairen van kleinere diameter. Werken bij deze schalen reduceert de routine studies en maakt mogelijk studies dat het gebruik van kostbare reagentia en / of cellen vereise…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Ronald F. Renzi en Michael S. Bartsch voor hun bijdrage aan het ontwerp en de ontwikkeling van DMF apparaten en de DMF-hub. Dit onderzoek werd volledig ondersteund door het Laboratorium Geregisseerd Research en Development programma bij Sandia National Laboratories. Sandia is een multi-programma laboratorium beheerd en geëxploiteerd door Sandia Corporation, een volledige dochteronderneming van Lockheed Martin Corporation, voor de US Department of Energy's National Nuclear Security Administration onder contract DE-AC04-94AL85000.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |