Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione
Summary
Abbiamo sviluppato una coltura cellulare automatizzata e piattaforma di interrogatorio per esperimenti di stimolazione cellulare micro-scala. La piattaforma offre un controllo semplice, versatile e preciso nel coltivare e stimolare le piccole popolazioni di cellule, e recuperando lisati per le analisi molecolari. La piattaforma è adatto a studi che impiegano cellule preziosi e / o reagenti.
Abstract
Studio delle cellule in coltura (analisi in vitro) ha fornito indicazioni importanti in sistemi biologici complessi. I metodi convenzionali e attrezzature per analisi in vitro sono adatti per lo studio di un gran numero di cellule (≥ 10 5) in volumi millilitro scala (≥ 0,1 ml). Tuttavia, ci sono molti casi in cui è necessario o auspicabile ridimensionare dimensione coltura per ridurre il consumo delle cellule di interesse e / o reagenti richiesti per la loro cultura, la stimolazione, o la trasformazione. Purtroppo, gli approcci tradizionali non supportano la manipolazione precisa e riproducibile di culture micro-scala, e dei sistemi automatizzati microfluidica a base attualmente disponibili sono troppo complesse e specializzate per l'uso di routine dalla maggior parte dei laboratori. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una piattaforma tecnologica semplice e versatile per la cultura automatizzata, la stimolazione, e il recupero di piccole popolazioni di cellule (100 – 2.000 cellule) nel volume di micro-scalas (1 – 20 l). La piattaforma è costituita da un insieme di microcapillari fibronectina-rivestito ("camere di perfusione delle cellule"), all'interno del quale sono stabilite le culture micro-scala, mantenuti e stimolati; un dispositivo digitale di microfluidica (DMF) equipaggiati con "trasferimento" microcapillari ("hub centrale "), quali cellule rotte e reagenti da e verso le camere di perfusione; una pompa a siringa ad alta precisione, che trasportano i poteri di materiali tra le camere di perfusione e il mozzo centrale, e un'interfaccia elettronico che consente di controllare il trasporto di materiali, che è coordinato e automatizzato tramite script pre-determinati. Come esempio, abbiamo utilizzato la piattaforma per facilitare lo studio di risposte trascrizionali indotte in cellule immunitarie upon sfida con i batteri. Utilizzo della piattaforma ci ha permesso di ridurre il consumo di cellule e reagenti, minimizzare la variabilità esperimento a esperimento, e ri-diretti hands-on del lavoro. Considerati i vantaggi che essa conferisce, così come la sua accessibilità e versatilità, opiattaforma ur dovrebbe trovare uso in un'ampia varietà di laboratori e applicazioni, e rivelarsi particolarmente utile nel facilitare l'analisi di cellule e stimoli che sono disponibili solo in quantità limitate.
Introduction
Lo studio delle cellule mantenute in coltura (analisi in vitro) ha fornito preziose informazioni sui principi fondamentali e dei meccanismi molecolari che regolano i complessi sistemi biologici e la salute umana. I metodi convenzionali per la cultura, la stimolazione, e la raccolta di cellule per l'analisi, che utilizzano capsule di Petri e micropiastre, sono stati progettati per lo studio di grandi popolazioni di cellule (≥ 10 5) in volumi di coltura millilitro scala (≥ 0,1 ml). Tuttavia, ci sono molti casi in cui sono disponibili soltanto quantità limitate di cellule (per esempio cellule primarie), o piccole popolazioni di cellule sono desiderabili (es. ridurre cellula-cellula variabilità nella popolazione), o reagenti necessari sono difficili da ottenere o costi proibitivi (ad es purificati fattori cellula-secrete). Tali problemi possono essere affrontati con successo dal ridimensionamento dimensione culturale, che ha il vantaggio di ridurre il consumo di tutti ireagenti necessari per l'analisi in vitro 1,2. Purtroppo, attrezzature e metodi convenzionali non supportano la manipolazione precisa e riproducibile di culture micro-scala ed i sistemi automatizzati di microfluidica a base attualmente disponibili 3-11 sono troppo complesse e specializzate per l'uso di routine dalla maggior parte dei laboratori.
In questo rapporto, descriviamo il montaggio e l'uso di una piattaforma tecnologica semplice e versatile per la cultura automatizzata, la stimolazione, e il recupero di piccole popolazioni di cellule (100 – 2.000 cellule) in volumi di micro-scala (1-20 ml). L'architettura della piattaforma (Figura 1) ha un design modulare: una serie di fibronectina rivestito microcapillari ("camere di perfusione delle cellule" modulo) serve come sito per la creazione, la manutenzione e la stimolazione delle colture micro-scala, e una microfluidica digitale (DMF ) 12,13 dispositivo equipaggiato con il "trasferimento" microcapillari (modulo "centrale hub") 14,15 celle rottee reagenti da e per le camere di perfusione. DMF consente all'utente di affrontare individualmente multiple goccioline simultaneamente e per modificare o ri-ordinare le manipolazioni (cioè riconfigurare i treni di trattamento del campione) senza modificare l'hardware del dispositivo. La sua grande flessibilità è evidente nella sua recente comparsa come una tecnologia chiave in una vasta gamma di applicazioni, tra cui la coltura cellulare 16,17, saggi enzimatici 18,19, 20,21 immunologici, analisi del DNA 22,23, trasformazione delle proteine, 24,25 clinica e trattamento dei campioni. 26,27 nostro mozzo centrale sfrutta la flessibilità inerente ai dispositivi DMF, e migliora ulteriormente attraverso l'aggiunta di interfacce microcapillari, che fornisce opportunità di realizzare un sottoinsieme di manipolazioni (es. coltura cellulare) in periferico specializzato moduli, piuttosto che sul dispositivo DMF stesso. Compartimentazione dei treni di elaborazione in questo modo semplifica anche la progettazione del plaarchitettura TForm (nessun bisogno di costruire un dispositivo di DMF in grado di eseguire tutte le fasi di lavorazione) e facilita la sua evoluzione come nuove funzioni sono necessarie (semplicemente integrare nuovi moduli periferici, se necessario). Trasporto delle cellule e reagenti all'interno del mozzo centrale è guidato da elettrowetting forze generate mediante attivazione sequenziale di elettrodi all'interno del dispositivo di DMF 13,28, trasporti verso, da e all'interno delle camere di perfusione è alimentato da variazioni di pressione generate da una siringa ad alta precisione pompa. Tutti questi movimenti fluidi sono controllati tramite una semplice interfaccia elettronica e automatizzata mediante l'utilizzo di script pre-determinati.
Come esempio rappresentativo, dimostriamo l'utilizzo della piattaforma per lo studio delle risposte trascrizionali suscitato in cellule del sistema immunitario su sfida con i batteri (Figura 2). Svolgimento di tali esperimenti sulla piattaforma ci ha permesso di lavorare con un piccolo numero di cellule (~ 1.000 per sperimentazionecondizione Tal), ridurre al minimo la variabilità esperimento a esperimento, i reagenti conservare, e ri-diretto hands-on del lavoro. Considerati i vantaggi che essa conferisce, così come la sua accessibilità e versatilità, questa piattaforma dovrebbe trovare uso in un'ampia varietà di laboratori e applicazioni e rivelarsi particolarmente utile nel facilitare l'analisi di cellule e stimoli che sono disponibili solo in quantità limitate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato una piattaforma automatizzata semplice e versatile per la coltura cellulare micro-scala e di esperimenti di stimolazione. La piattaforma consente di lavorare con piccoli volumi di coltura e le popolazioni di cellule (1-20 ml e 100 – 2.000 cellule, per camera); dimensioni cultura potrebbe essere ulteriormente ridotto mediante l'utilizzo di microcapillari di diametro inferiore. Lavorare in queste scale riduce il costo degli studi di routine e rende realizzabili gli studi che richiedono l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Ronald F. Renzi e Michael S. Bartsch per i loro contributi alla progettazione e sviluppo di dispositivi di DMF e l'hub DMF. Questa ricerca è stata interamente sostenuta dal Laboratorio di Regia Programma di ricerca e sviluppo presso i Sandia National Laboratories. Sandia è un laboratorio multi-programma gestito e gestito da Sandia Corporation, una consociata interamente controllata di Lockheed Martin Corporation, per il Dipartimento della National Nuclear Security Administration di Energia degli Stati Uniti sotto contratto DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
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