마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼
Summary
우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.
Abstract
문화의 세포 (체외 분석)의 연구는 복잡한 생물학적 시스템에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 생체 분석을위한 기존의 방법과 장비가 잘 밀리미터 규모의 볼륨 (≥ 0.1 ml)에 세포 (≥ 10 5) 다수의 연구 적합합니다. 그러나, 관심 및 / 또는 그들의 문화, 자극, 또는 처리에 필요한 시약 세포의 소비를 줄이기 위해 문화 크기를 확장 할 필요하거나 바람직되는 많은 경우가 있습니다. 불행하게도, 기존의 접근 방식은 마이크로 스케일 문화의 정확하고 재현성 조작을 지원하지 않으며, 현재 사용 가능한 미세 유체 기반의 자동화 된 시스템이 너무 복잡하고 대부분의 실험실에 의해 일상적인 사용을위한 전문입니다. 마이크로 스케일의 볼륨 -이 문제를 해결하기 위해, 우리는 자동화 된 문화, 자극, 세포의 작은 인구 (2,000 세포 100)의 복구를 위해 간단하고 다양한 기술 플랫폼을 개발했습니다S (1 – 20 μL). 이 플랫폼은 마이크로 스케일 문화를 확립, 유지 및 자극하는 내 fibronectin의 코팅 microcapillaries ( "세포 관류 실")의 집합으로 구성되어 "전송"microcapillaries ( "중앙 허브에 장착 된 디지털 마이크로 유체 (DMF) 장치 ")하고 재관류 챔버에서 루트 세포 및 시약되는, 힘의 재관류 챔버와 중앙 허브 사이의 자료 전송 고정밀 주사기 펌프, 어떤, 재료의 전송 제어 기능을 제공하는 전자 인터페이스입니다 조정과 미리 정해진 스크립트를 통해 자동화. 예를 들어, 우리는 박테리아와 도전에 면역 세포에 이끌려 전사 반응의 연구를 촉진하는 플랫폼을 사용했다. 플랫폼의 사용은 우리가, 세포 및 시약의 소비를 줄이는 실험 – 투 – 실험 변동을 최소화 할 수있게하고, 다시 직접 손에 노동. 그것이 부여하는 장점뿐만 아니라 접근성과 다양성, 오 부여UR 플랫폼은 실험실과 응용 프로그램의 다양한 사용을 발견하고 제한된 수량에서 사용할 수있는 세포와 자극의 분석을 용이하게 특히 유용합니다.
Introduction
(체외 분석) 문화 유지 세포의 연구는 복잡한 생물학적 시스템과 인간의 건강을 지배하는 기본 원리와 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 문화, 자극, 그리고 페트리 요리의 microtiter 플레이트를 활용 분석을위한 세포의 수집을위한 기존의 방법은 밀리미터 규모의 문화 볼륨의 셀 (≥ 10 5) (≥ 0.1 ml)에 많은 인구 연구를 위해 설계되었습니다. 그러나, 세포의 제한된 양을 사용할 수있는 많은 경우 (예 : 일차 전지), 또는 세포의 작은 집단 (예를 들면 인구를 통해 휴대 전화의 변동성을 줄이기 위해) 바람직한, 또는 필요한 시약 얻기 어렵다 또는 엄청나게 비싼 (예 : 정제 된 세포 분비 인자). 이러한 문제를 성공적으로 배양 크기를 아래로 조정에 의해 해결 될 수있는 모든 소비를 줄이는 이점이 있습니다시약은 체외 분석 1,2에 필요합니다. 불행하게도, 기존의 장비와 방법은 마이크로 스케일의 문화와 3-11이 너무 복잡하고 대부분의 실험실에 의해 일상적인 사용을위한 전문화되어 현재 사용할 수있는 미세 유체 기반의 자동화 된 시스템의 정확하고 재현성 조작을 지원하지 않습니다.
마이크로 스케일 볼륨에서 (1 – 20 μL) -이 보고서에서, 우리는 자동으로 문화, 자극, 세포의 작은 인구 (2,000 세포 100)의 복구를위한 간단하고 다양한 기술 플랫폼의 조립 및 사용을 설명합니다. 피브로넥틴 코팅 microcapillaries는 ( "세포 관류 실"모듈) 마이크로 스케일 문화의 확립, 유지 보수 및 자극에 대한 사이트 역할의 집합, 그리고 디지털 마이크로 유체 (DMF : 플랫폼 아키텍처 (그림 1) 모듈 식 디자인 "전송"microcapillaries ( "중앙 허브"모듈) 14,15 노선 세포 장착) 12,13 장치과하고 재관류 챔버에서 시약. DMF는 사용자가 개별적으로 동시에 여러 방울을 해결하고 장치 하드웨어를 변경하지 않고 조작을 (예 : 재구성 샘플 처리 기차)를 변경하거나 다시 주문 할 수 있습니다. 그 엄청난 유연성 세포 배양 16, 17, 효소 분석 18,19, 면역 20,21, DNA 분석 22,23, 단백질 처리, 24,25 등 다양한 애플리케이션의 핵심 기술로 최근의 출현에 분명하다 임상 검체 처리. 26,27 우리의 중앙 허브는 DMF 장치에 내재 된 유연성을 활용, 더욱 전문화 된 주변 장치의 조작의 일부를 (예를 들어, 세포 배양) 수행 할 기회를 제공 microcapillary 인터페이스의 추가를 통해 향상 오히려 DMF 장치 자체에보다 모듈. 이런 방식으로 처리 열차의 구획화는 괞 찮아의 설계를 단순화TForm 클래스 아키텍처 (모든 처리 단계를 수행 할 수 DMF 장치를 구축 할 필요 없음) 새로운 함수로의 진화를 촉진는 (단순히 필요에 따라 새로운 주변 장치 모듈을 통합)가 필요합니다. 중앙 허브에서 세포 및 시약의 수송은 DMF 장치 13,28 내에 전극을 순차적으로 활성화에 의해 생성 된 힘 전기 습윤에 의해 구동됩니다;에서 전송로 및 재관류 챔버 내에서 고정밀 주사기에 의해 생성 된 압력 변화에 의해 제공됩니다 펌프. 이러한 유체 움직임의 모든 간단한 전자 인터페이스를 통해 제어되고 미리 정해진 스크립트를 사용하여 자동화되어 있습니다.
대표적인 예로서, 우리는 박테리아의 반칙으로 (그림 2)에 따라 면역 세포에 이끌려 전사 반응의 연구를위한 플랫폼을 사용하는 방법을 보여줍니다. 플랫폼에서 이러한 실험을 수행하는 것은 우리가 세포의 작은 숫자 (experimen 당 ~ 1,000 작동 할 수있게탈 조건), 실험 – 투 – 실험 다양성, 보존 시약 및 노동 손에 다시 직접을 최소화합니다. 그것이 부여하는 장점뿐만 아니라 접근성과 다양성을 감안할 때,이 플랫폼은 실험실과 응용 프로그램의 다양한 사용을 발견하고 제한된 수량에서 사용할 수있는 세포와 자극의 분석을 용이하게 특히 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 마이크로 규모의 세포 배양과 자극 실험을위한 간단하고 다양한 자동화 플랫폼을 개발했습니다. 문화 크기는 더 작은 직경의 microcapillaries의 사용을 통해 줄일 수 있으며, 플랫폼은 우리가 작은 문화 볼륨 및 세포 인구 (- – 20 μL, 100 2000 세포 챔버 당 1 개)를 사용하여 작업 할 수 있습니다. 이러한 규모에서 작업 루틴 연구의 비용을 절감하고 귀중한 시약 및 / 또는 세포의 사용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 DMF 장치와 DMF 허브의 설계 및 개발에 대한 그들의 공헌에 대한 로널드 F. Renzi의 마이클 S. BARTSCH 감사합니다. 이 연구는 완전히 디아 국립 연구소의 연구실 감독 연구 개발 프로그램에 의해 지원되었다. 샌디 계약 DE-AC04-94AL85000에서 에너지의 국립 핵 보안 관리의 미국학과에 대한 Sandia 공사, 록히드 마틴사의 자회사에 의해 관리 및 운영 멀티 프로그램 실험실이다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
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