A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares
Summary
Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.
Abstract
Estudo de células em cultura (análise in vitro) forneceu importantes insights sobre sistemas biológicos complexos. Os métodos convencionais e equipamentos para a análise in vitro são bem adequados ao estudo de um grande número de células (≥ 10 5) em volumes mililitro escala ≥ (0,1 ml). No entanto, há muitos casos em que é necessário ou desejável reduzir a dimensão de tamanho para reduzir o consumo de cultura das células de interesse e / ou os reagentes necessários para a sua cultura, a estimulação ou processamento. Infelizmente, as abordagens convencionais não suportam manipulação precisa e reprodutível de culturas micro-escala, e os sistemas automatizados baseados em microfluídica atualmente disponíveis são muito complexos e especializados para uso de rotina pela maioria dos laboratórios. Para resolver este problema, foram desenvolvidos uma plataforma de tecnologia simples e versátil para a cultura automatizado, estimulação e recuperação de pequenas populações de células (100 – 2000 células) no volume de micro-escalas (1 – 20 ul). A plataforma é constituído por um conjunto de microcapilares revestidos com fibronectina ("câmaras de perfusão de células"), no qual as culturas de micro-escala são estabelecidos, mantida e estimulada, um dispositivo digital de microfluidos (DMF) equipado com "transfer" microcapilares ("hub central "), que as células e reagentes rotas de e para as câmaras de perfusão, uma bomba de seringa de alta precisão, que o transporte de materiais de poderes entre as câmaras de perfusão eo hub central, e uma interface eletrônica que fornece controle sobre o transporte de materiais, o que é coordenado e automatizados via pré-determinados scripts. Como um exemplo, utilizou-se a plataforma para facilitar o estudo de respostas eliciadas transcrição em células imunes ao desafio com bactérias. A utilização da plataforma permitiu-nos a reduzir o consumo de células e reagentes, minimizar a variabilidade experiência para experiência e reorientar as mãos sobre o trabalho. Dadas as vantagens que ela confere, assim como a sua acessibilidade e versatilidade, oplataforma ur deve encontrar o uso em uma ampla variedade de laboratórios e aplicações, e revelar-se especialmente útil para facilitar a análise de células e os estímulos que estão disponíveis apenas em quantidades limitadas.
Introduction
O estudo de células mantidas em cultura (análise in vitro) forneceu uma visão valiosa sobre os princípios fundamentais e os mecanismos moleculares que regem os sistemas biológicos complexos ea saúde humana. Os métodos convencionais de cultura, estimulação e coleta de células para análise, que utilizam placas de Petri e placas de poliestireno, foram projetados para o estudo de grandes populações de células (≥ 10 5) em volumes de cultura mililitro escala (≥ 0,1 ml). No entanto, há muitos casos em que apenas quantidades limitadas de células estão disponíveis (por exemplo, as células primárias), ou de pequenas populações de células são desejáveis (por exemplo, para reduzir a variabilidade de-célula através da população), ou os reagentes necessários são de difícil obtenção ou proibitivamente caro (por exemplo, células purificadas fatores secretados). Tais questões podem ser abordadas com sucesso pelo redimensionamento tamanho cultura, que tem a vantagem de reduzir o consumo de todos osOs reagentes necessários para a análise in vitro, em 1,2. Infelizmente, equipamentos e métodos convencionais não suportam manipulação precisa e reprodutível de culturas micro-escala e os sistemas automatizados baseados em microfluídica atualmente disponíveis 3-11 são muito complexas e especializadas para uso de rotina pela maioria dos laboratórios.
Neste relatório, nós descrevemos a montagem e utilização de uma plataforma de tecnologia simples e versátil para a cultura automatizada, estimulação e recuperação de pequenas populações de células (100 – 2000 células) em volumes micro-escala (1-20 mL). A arquitetura da plataforma (Figura 1) é um projeto modular: um conjunto de fibronectina revestido microcapilares ("câmaras de perfusão de células" Módulo), que serve como local para o estabelecimento, manutenção e estimulação das culturas micro-escala, e uma microfluídica digital (DMF ) 12,13 dispositivo equipado com "transfer" microcapilares (módulo central "hub") 14,15 células rotase reagentes de e para as câmaras de perfusão. DMF permite ao usuário resolver individualmente várias gotas em simultâneo e de alterar ou re-ordenar as manipulações (ou seja, os trens de processamento de amostras reconfigurar) sem alterar o hardware do dispositivo. A sua grande flexibilidade é evidente em seu surgimento recente como uma tecnologia chave numa vasta gama de aplicações, incluindo a cultura da célula 16,17 18,19 ensaios enzimáticos, os imunoensaios 20,21, 22,23 A análise do DNA, o processamento de proteínas, 24,25 e processamento de amostras clínicas. 26,27 Nossa cubo central aproveita a flexibilidade inerente aos dispositivos de DMF, e aumenta ainda mais através da adição de interfaces de microcapilares, que proporciona oportunidade para a realização de um subconjunto de manipulações (por exemplo, cultura de células) em periférico especializado módulos, em vez de no próprio dispositivo de DMF. A compartimentalização dos comboios de processamento deste modo também simplifica a concepção do plaarquitetura TForm (não é necessário para construir um dispositivo DMF que pode realizar todas as etapas de processamento) e facilita a sua evolução à medida que novas funções são necessárias (simplesmente integrar novos módulos periféricos como necessário). Transporte de células e reagentes dentro do cubo central é accionado por electrowetting forças geradas pela activação sequencial dos eléctrodos no interior do dispositivo de DMF 13,28; transporte para, de e no interior das câmaras de perfusão é alimentado por alterações de pressão geradas por uma seringa de alta precisão bomba. Todos esses movimentos fluidos são controlados através de uma interface eletrônica simples e automatizado através da utilização de pré-determinados scripts.
Como um exemplo representativo, que demonstram a utilização da plataforma para o estudo das respostas da transcrição induzida em células do sistema imune após o desafio com bactérias (Figura 2). Realizar esses experimentos na plataforma nos permitiu trabalhar com um pequeno número de células (~ 1.000 por experimentaçãotal condição), para minimizar a variabilidade experiência-to-experimento, reagentes conservar e re-direta hands-on de trabalho. Dadas as vantagens que ela confere, assim como a sua acessibilidade e versatilidade, esta plataforma deve encontrar utilização numa ampla variedade de aplicações e de laboratórios e ser especialmente útil para facilitar a análise de células e os estímulos que estão disponíveis em quantidades limitadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós desenvolvemos uma plataforma automatizada simples e versátil para a cultura de células micro-escala e experiências de estimulação. A plataforma permite-nos trabalhar com pequenos volumes de cultura e populações celulares (1-20 mL e 100 – 2000 células, por câmara); tamanhos cultura pode ser ainda mais reduzida com o uso de microcapilares de menor diâmetro. Trabalhando em ambas as escalas reduz o custo de estudos de rotina e faz estudos viáveis, que requerem o uso de reagentes preciosos e / ou de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Ronald F. Renzi e Michael S. Bartsch por suas contribuições para a concepção e desenvolvimento de dispositivos de DMF eo hub DMF. Esta pesquisa foi totalmente suportado pelo Laboratório Direção de Pesquisa e Programa de Desenvolvimento do Sandia National Laboratories. Sandia é um laboratório multi-programa gerenciado e operado pela Sandia Corporation, uma subsidiária integral da Lockheed Martin Corporation, para o Departamento de Administração de Segurança Nacional de Energia Nuclear dos EUA sob contrato DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
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