Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration
Summary
I denne artikel vil vi præsentere hurtige mikro-iontophoresis af neurotransmittere som en teknik til at undersøge integration af postsynaptiske signaler med høj rumlig og tidsmæssig præcision.
Abstract
En af de grundlæggende interesser i neurovidenskab er at forstå integrationen af stimulerende og hæmmende inputs langs meget kompleks struktur af dendritiske træet, som i sidste ende fører til neuronal output virkningspotentialer på Axon. Indflydelsen af forskellige rumlige og tidslige parametre for specifik synaptisk input om neuronal output er i øjeblikket under efterforskning, f.eks distance-afhængige dæmpning af dendritiske inputs, placering-afhængig interaktion af rumligt adskilte indgange indflydelse GABAergig hæmning på excitatory integration, lineær og ikke-lineære integration modes, og mange flere.
Med hurtig mikro-iontoforese af glutamat og GABA det er muligt præcist at undersøge den rumlige og tidsmæssige integration af glutamaterge excitation og GABAerg hæmning. Kritiske tekniske krav er enten en udløst lysstofrør, light-emitting diode (LED), eller en to-foton scaLønning mikroskop for at visualisere dendritiske grene uden at indføre betydelige foto-beskadigelse af vævet. Endvidere er det meget vigtigt at have en mikro-iontoforese forstærker, der giver mulighed for hurtig kapacitans kompensation af høje resistensniveauer pipetter. Et andet afgørende punkt er, at ingen sender ufrivilligt er udgivet af pipetten under eksperimentet.
Når de er etableret, vil denne teknik giver pålidelige og reproducerbare signaler med en høj neurotransmitter og beliggenhed specificitet. Sammenlignet med glutamat og GABA uncaging, hurtig iontoforese tillader brug begge sendere på samme tid, men i meget fjerntliggende steder uden begrænsning til synsfeltet. Der er også fordele i forhold til fokal elektrisk stimulering af axoner: med mikro-iontoforese placeringen af input site er absolut kendt, og det er sikkert, at kun neurotransmitter interesse frigives. Skal det imidlertid tages i betragtning, at med mikro-iontoforese kunpostsynapse aktiveres, og præsynaptiske aspekter af neurotransmitter release er ikke løst. I denne artikel vil vi vise, hvordan du opsætter mikro-iontophoresis i hjernen skive eksperimenter.
Introduction
Neuroner i centralnervesystemet modtage en række synaptiske input på deres tynde og forgrenet dendritiske processer 1.. Der er de fleste af de excitatoriske dendritiske inputs medieret af glutamaterge synapser. Disse synapser kan aktiveres i et rumligt distribueret måde, hvilket resulterer i postsynaptiske lineær integration af excitatoriske postsynaptiske potentialer (EPSP'er). Hvis synapser aktiveres samtidig og fysisk nærhed på dendritceller, kan disse excitatory indgange integreres overnationale lineært og generere dendritiske spikes 2-5.
Integreringen af excitatoriske inputs afhænger placeringen af indgangen på dendritiske træet. Signaler, der ankommer ved den distale tot region er meget mere svækket end proksimale inputs grund kabel filtrering 6.. I hippocampus er fjernt inputs til de apikale tot dendritter genereret af en anden hjerne region end dem på proximal dendrites 7.. En spændende spørgsmål er derfor, er hvordan synaptic input behandles af forskellige dendritiske rum, og hvis dendritiske integration regulerer indflydelse disse lagdelte indgange på neuronfyring på forskellige måder.
Ikke blot de funktionelle egenskaber, morfologiske funktioner i dendritceller er placering og gruppering af de input, der påvirker dendritiske integration af excitatoriske inputs, også de ekstra hæmmende input fra GABAergic terminaler afgørende fastlægge effekten af de glutamaterge synapser 8,9. Disse forskellige aspekter af synaptisk integration kan være ideelt undersøgt ved hjælp neurotransmitter mikro-iontophoresis, som giver rumligt definerede anvendelse af forskellige neurotransmittere til dendritiske domæner. Vi viser her, hvordan man kunne etablere mikro-iontophoresis af glutamat og GABA til at undersøge signal integration i neuroner.
For denne ansøgning, fin spidshøje resistensniveauer pipetter fyldt med koncentrerede neurotransmitter løsninger anvendes. Disse pipetter er placeret tæt på den ydre membran af cellen, hvor neurotransmitter receptorer er lokaliseret. En god visualisering af dendritiske grene er påkrævet. Dette opnås bedst ved hjælp af fluorescerende farvestoffer, som indføres via patch-pipetten. Derefter en meget kort (<1 ms) strømimpuls (i intervallet 10 til 100 nA) anvendes til at udstøde de ladede signalstoffer. Med disse korte pulser og effektiv kapacitans kompensation, kan postsynaptiske potentialer eller strømninger blive fremkaldt med høj tidsmæssig og rumlig præcision, hvilket betyder placeringen af excitatoriske input kendes nøjagtigt. Glutamat mikro-iontoforese kan aktivere synapser i en defineret radius, der er mindre end 6 um som vist her (figur 1 9), men det er også muligt at nå enkelt synapse opløsning 10-12.
Heine, M., et al </em> viste, at den rumlige opløsning af hurtige mikro-iontoforese selv kan justeres til at spotte størrelser under 0,5 um, hvilket er mindre end pletstørrelser regelmæssigt opnås med to-foton uncaging af glutamat 13.. Med hurtig mikro-iontophoresis er det let muligt at anvende to eller flere iontoforetiske pipetter og placere dem på forskellige, selv fjerntliggende steder på dendritiske træ. På denne måde kan integration af ophidsende begivenheder, herunder fra forskellige veje, undersøges. Det er også muligt at anvende en glutamat og en GABA fyldt iontoforetisk pipette samtidigt. På denne måde virkningen af GABAerg hæmning på forskellige steder i forhold til den excitatoriske indgang (på vej, off-sti inhibering) kan studeres. Også virkningen af hæmning af interneuroner rettet mod specifikke neuronale domæner ligesom distale dendritter, soma eller axoner 14, kan undersøges ved hjælp af GABA iontophoresis. I dyrkede neuroner, tilbyder hurtig mikro-iontophoresis mulighed for at investigate enkelt synapse distribution og de elementære aspekter af synaptisk kommunikation i neuroner i meget mere detaljeret 10,11.
I denne artikel vil vi demonstrere i detaljer, hvordan man etablere glutamat og GABA iontophoresis til brug i akutte hjernen skiver, som giver efterforsker synaptisk integration af excitatoriske og hæmmende inputs i afhængighed input placering, input styrker, og timing, alene eller i samspil. Vi vil påpege fordele og begrænsninger ved denne teknik, og hvordan du foretager fejlfinding med succes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her forklarer vi, hvordan man anvender hurtige mikro-iontophoresis af neurotransmittere til at undersøge synaptisk integration på dendritter. Denne teknik er med succes blevet anvendt til at undersøge glutamaterge og GABAerg synaptisk transmission i forskellige hjerneområder in vitro og in vivo 9,20-22. Micro-iontophorese har været anvendt i mere end 60 år, men i de tidlige år var det meste bruges til enten lokalt anvende neurotransmittere og narkotika på langsomme eller mellemliggende tidssk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann og Walker Jackson for omhyggeligt at læse manuskriptet. Forfatterne har modtaget støtte, der blev leveret af Ministeriet for forskning MIWF af statens Nordrhein-Westfalen (SR), Den BMBF-Projekträger DLR US-tyske samarbejde i beregningsmæssige neurovidenskab (CRCNS, SR), Centers of Excellence i neurodegenerative sygdomme (COEN; SR), og universitetet i Bonn intramuralt finansieringsprogram (BONFOR, SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
