Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek
Summary
In dit artikel zullen we snel micro-iontoforese van neurotransmitters als een techniek om de integratie van postsynaptische signalen met een hoge ruimtelijke en temporele precisie onderzoeken.
Abstract
Een fundamenteel belang in neurologie is de integratie van prikkelende en remmende inputs langs het complexe structuur van de dendritische structuur, die uiteindelijk leidt tot neuronale productie van actiepotentialen in de axon begrijpen. De invloed van verschillende ruimtelijke en temporele parameters van specifieke synaptische invoer op neuronale uitgang wordt momenteel onderzocht, bijvoorbeeld de afstand verzwakking van dendritische inputs, de locatie-afhankelijke interactie van ruimtelijk gescheiden ingangen, de invloed van GABAergig remming van prikkelende integratie lineaire en niet-lineaire integratiemodi, en veel meer.
Met snelle micro-iontoforese van glutamaat en GABA is het mogelijk om de ruimtelijke en temporele integratie van glutamaat en GABA-erge remming excitatie nauwkeurig onderzoeken. Kritische technische eisen zijn ofwel een triggered fluorescentielamp, light-emitting diode (LED), of een twee-foton scanning microscoop om dendritische takken visualiseren zonder de invoering van belangrijke foto-beschadiging van het weefsel. Voorts is het zeer belangrijk om een micro-iontoforese versterker die zorgt voor een snelle capaciteit compensatie hoge weerstand pipetten. Een ander belangrijk punt is dat er geen zender onvrijwillig wordt vrijgegeven door de pipet tijdens het experiment.
Eenmaal ingesteld, zal deze techniek betrouwbare en reproduceerbare signalen met een hoge neurotransmitter en locatie specificiteit. Vergeleken met glutamaat en GABA uncaging, snel iontoforese kan met beide zenders tegelijk maar bij zeer lange afstanden zonder beperking van het gezichtsveld. Er zijn ook voordelen tegenover focale elektrische stimulatie van axonen: met micro-iontoforese de plaats van de input site is precies bekend en het is zeker dat alleen de neurotransmitter plaats wordt losgelaten. Nochtans moet dat alleen het micro-iontoforese worden beschouwdpostsynapse wordt geactiveerd en presynaptische aspecten van neurotransmitters zijn niet opgelost. In dit artikel laten we zien hoe het opzetten van micro-iontoforese in de hersenen slice experimenten.
Introduction
Neuronen in het centrale zenuwstelsel ontvangt verschillende synaptische inputs op hun dunne vertakte dendritische uitlopers 1. Daar de meerderheid van de exciterende dendritische ingangen worden gemedieerd door glutamaat synapsen. Deze synapsen kan worden geactiveerd in een ruimtelijk verdeelde manier, wat resulteert in postsynaptische lineaire integratie van excitatoire postsynaptische potentialen (EPSPS). Als de synapsen gelijktijdig en in ruimtelijke nabijheid op de dendriet zijn geactiveerd, kunnen deze prikkelende input supra-lineair worden geïntegreerd en het genereren van dendritische spikes 2-5.
Bovendien is de integratie van excitatoire ingangen afhankelijk van de locatie van de ingang van de dendritische structuur. Signalen die aankomen op de distale tuft regio zijn veel meer verzwakt dan proximale ingangen vanwege kabel filtering 6. In de hippocampus, zijn verre input voor de apicale dendrieten plukje gegenereerd door een ander hersengebied dan die op proximale dendrites 7. Een interessante vraag is daarom wordt hoe synaptische ingang verwerkt dendritische verschillende compartimenten en als dendritische integratie regelt de invloed van deze gelaagde ingangen neuronale op verschillende manieren.
Niet alleen de functionele eigenschappen, morfologische kenmerken van de dendriet, de plaats en clustering van de ingangen die de dendritische integratie van prikkelende inputs, ook extra remmende inputs van GABAerge terminals cruciaal bepalen de doeltreffendheid van de glutamaat synapsen 8,9. Deze verschillende aspecten van synaptische integratie kan ideaal worden onderzocht met behulp neurotransmitter micro-iontoforese, die ruimtelijk gedefinieerde toepassing van verschillende neurotransmitters kunnen dendritische domeinen. We zien hier hoe de micro-iontoforese van glutamaat en GABA succes vast te signaalintegratie onderzoeken in neuronen.
Voor deze toepassing, fijne punthoge weerstand pipetten gevuld met geconcentreerde neurotransmitter oplossingen worden gebruikt. Deze pipetten dichtbij de buitenste membraan van de cel, waarbij de neurotransmitter receptoren zich bevinden geplaatst. Een goede visualisatie van de dendritische takken vereist. Dit wordt het beste bereikt met fluorescerende kleurstoffen die worden ingevoerd via de patch pipet. Vervolgens een zeer korte (<1 msec) stroompuls (in het bereik van 10-100 nA) wordt gebruikt om de geladen neurotransmittermoleculen werpen. Met deze korte pulsen en de effectieve capaciteit compensatie kunnen postsynaptische potentialen en stromen worden opgewekt met een hoge temporele en ruimtelijke nauwkeurigheid, waardoor de plaats van de exciterende ingang precies bekend. Glutamaat micro-iontoforese kan synapsen activeren in een bepaalde straal, die kleiner is dan 6 micrometer zoals hier getoond (Figuur 1 9), maar het is ook mogelijk om enkele oplossing synaps 10-12 bereiken.
Heine, M., et al. </em> bleek dat de ruimtelijke resolutie van fast micro-iontoforese ook kan worden ingesteld om de grootte onder 0,5 urn, die kleiner is dan spotgroottes regelmatig bereikt met twee-foton uncaging glutamaat 13 zien. Met snelle micro-iontoforese is het eenvoudig mogelijk om twee of meer iontoforetische pipetten gebruiken en plaats ze op verschillende, zelfs verre vlekken op de dendritische structuur. Op deze wijze kan de integratie van prikkelende gebeurtenissen, met inbegrip van verschillende paden worden onderzocht. Het is ook mogelijk om een glutamaat en GABA gevulde pipet iontoforetische tegelijkertijd gebruikt. Op deze manier wordt de werking van GABA-erge remming op verschillende locaties ten opzichte van de prikkelende ingang (on-pad, off-path remming) kan worden onderzocht. Ook het effect van remming door interneuronen richten op specifieke neuronale domeinen, zoals distale dendrieten, axonen soma of 14, te onderzoeken met behulp GABA iontoforese. In gekweekte neuronen, fast micro-iontoforese biedt de mogelijkheid om INVEstigate enkele synaps distributie en de elementaire aspecten van synaptische communicatie in neuronen in veel meer detail 10,11.
In dit artikel laten we zien in detail hoe glutamaat en GABA iontoforese voor het gebruik bij acute hersenen plakjes, die het mogelijk maakt te onderzoeken synaptische integratie van prikkelende en remmende input in afhankelijkheid van invoer plaats, ingang sterke punten, en de timing, alleen of in samenspel vestigen. We zullen wijzen op de voordelen en beperkingen van deze techniek en hoe succesvol oplossen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier leggen we uit hoe u snel micro-iontoforese van neurotransmitters toepassing op synaptische integratie te onderzoeken op de dendrieten. Deze techniek is met succes gebruikt voor Glu en GABA-erge synaptische transmissie onderzocht in verschillende hersengebieden in vitro en in vivo 9,20-22. Micro-iontoforese wordt al meer dan 60 jaar, maar in de vroege jaren werd meestal gebruikt om lokaal neurotransmitters en geneesmiddelen op langzame of tussenproducten tijdschema 23 of micro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann en Walker Jackson voor het zorgvuldig lezen van het manuscript. De auteurs ontvingen financiering die werd verstrekt door het ministerie van onderzoek MIWF van de staat Noordrijn-Westfalen (SR), de BMBF-Projekträger DLR US-Duitse samenwerking in computational neuroscience (CRCNS, SR), Centers of Excellence in neurodegeneratieve ziekten (COEN; SR), en de Universiteit van Bonn intramurale programmafinanciering (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
