Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen
Summary
In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.
Abstract
Eines der grundlegenden Interessen in den Neurowissenschaften ist es, die Integration von erregenden und hemmenden Eingänge entlang der sehr komplexen Struktur der dendritischen Baumes, die schließlich führt zu neuronalen Ausgang der Aktionspotentiale am Axon verstehen. Der Einfluss verschiedener räumlicher und zeitlicher Parameter des spezifischen synaptischen Eingang neuronale Ausgang wird derzeit untersucht, z. B. den Abstand Dämpfung von dendritischen Eingänge, die ortsabhängige Wechselwirkung von räumlich getrennten Eingängen der Einfluss GABAergig Hemmung exzitatorischen Integration linearen und nichtlineare Integration Modi und vieles mehr.
Mit schnellen Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA ist es möglich, genau zu untersuchen, die räumliche und zeitliche Integration der glutamatergen Anregung und GABAergen Hemmung. Critical technischen Anforderungen entweder eine ausgelöste Leuchtstofflampe, Leuchtdiode (LED) oder eine Zwei-Photonen-scanning Mikroskop zu dendritischen Zweigen, ohne dabei signifikante Foto-Schädigung des Gewebes sichtbar zu machen. Weiterhin ist es sehr wichtig, eine Mikro-Verstärker Iontophorese, das eine schnelle Kompensation der Kapazität hohe Pipetten ermöglicht haben. Ein weiterer entscheidender Punkt ist, dass kein Sender unfreiwillig durch die Pipette während des Experiments veröffentlicht.
Einmal eingerichtet, wird diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Signale mit einer hohen Spezifität Neurotransmitter und Lage geben. Im Vergleich zu Glutamat und GABA Uncaging, ermöglicht eine schnelle Iontophorese mit beiden Sendern gleichzeitig aber zu sehr weit entfernten Orten ohne Einschränkung des Sichtfeldes. Es gibt auch Vorteile gegenüber Schwerpunkt elektrische Stimulation von Axonen: mit Mikro-Iontophorese die Lage des Eingangs Website ist definitiv bekannt und es ist sicher, dass nur der Neurotransmitter von Interesse freigesetzt wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass mit Mikro-Iontophorese werden nur diePostsynapse aktiviert und präsynaptischen Aspekte der Freisetzung von Neurotransmittern werden nicht aufgelöst. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen, wie Sie Mikro-Iontophorese in Hirnschnitt Experimente.
Introduction
Neuronen im zentralen Nervensystem erhalten eine Vielzahl von synaptischen Eingänge auf ihren dünnen und verzweigten dendritischen Prozesse 1. Es sind die meisten der exzitatorischen dendritischen Eingänge glutamatergen Synapsen vermittelt. Diese Synapsen in einem räumlich verteilten Weise aktiviert werden, was zu postsynaptischen lineare Integration von exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP). Wenn die Synapsen gleichzeitig und in räumlicher Nähe auf der Dendriten aktiviert sind, können diese exzitatorischen Eingänge supra-linear integriert werden und erzeugen dendritische Dornen 2-5.
Darüber hinaus hängt die Integration von exzitatorischen Eingänge von der Lage des Eingangs auf die dendritische Struktur. Signale, die am distalen Büschel Region ankommen sind viel stärker gedämpft als proximalen Eingänge aufgrund Kabel Filterung 6. Im Hippocampus, werden entfernte Eingänge zu den apikalen Dendriten Büschel durch eine andere Hirnregion als die auf proximalen dendri erzeugttes 7. Eine spannende Frage ist daher, wie synaptische Input von verschiedenen dendritischen Fächer verarbeitet und wenn dendritischen Integration regelt den Einfluss dieser geschichteten Eingänge auf neuronale Aktivität in unterschiedlicher Weise.
Nicht nur die funktionellen Eigenschaften, morphologische Merkmale des Dendriten, sind der Ort und die Clusterbildung der Eingänge, die die dendritische Integration von exzitatorischen Eingänge, die auch die zusätzliche hemmende Eingänge von GABAergen Terminals bestimmen maßgeblich die Wirksamkeit der glutamatergen Synapsen 8,9. Diese verschiedenen Aspekte der synaptischen Integration lässt sich ideal mit untersucht werden Neurotransmitter Mikro-Iontophorese, die räumlich definierte Anwendung verschiedener Neurotransmitter ermöglicht dendritischen Domänen. Wir zeigen hier, wie man erfolgreich etablieren Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA um das Signal Integration in Neuronen zu untersuchen.
Für diese Anwendung, spitzenhohe Beständigkeit Pipetten mit konzentrierter Neurotransmitter Lösungen gefüllt werden. Diese Pipetten sind in der Nähe der äußeren Membran der Zelle, wobei die Neurotransmitter-Rezeptoren befinden positioniert. Eine gute Visualisierung der dendritischen Äste erforderlich. Dies wird am besten durch Fluoreszenzfarbstoffe, die über der Patch-Pipette eingeführt werden. Dann wird eine sehr kurze (<1 ms) Stromimpuls (im Bereich 10 – 100 nA) verwendet wird, um die geladenen Neurotransmittermolekülen auszuwerfen. Mit diesen kurzen Pulsen und effektive Kapazität Kompensation kann postsynaptischen Potentiale oder Ströme mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision, die die Lage des exzitatorischen Eingang genau bekannt ist bedeutet hervorgerufen werden. Glutamate Mikro-Iontophorese kann Synapsen in einem definierten Radius, der kleiner als 6 um, wie hier (1 9) gezeigt wird, zu aktivieren, sondern es ist auch möglich, einzelne Synapse Auflösung 10-12 zu erreichen.
Heine, M., et al </em> zeigte, dass die räumliche Auflösung des schnellen Mikro-Iontophorese auch eingestellt werden, um Größen unterhalb 0,5 um, die kleiner als Messfelder regelmäßig mit zwei Photonen Uncaging von Glutamat 13 erreicht, zu beschmutzen. Mit schnellen Mikro-Iontophorese ist es leicht möglich, zwei oder mehr iontophoretisches Pipetten verwenden und legen Sie sie in verschiedenen, auch weit entfernte Punkte auf der dendritischen Baum. Auf diese Weise läßt sich der Einbau von exzitatorischen Ereignisse, einschließlich der aus den verschiedenen Wegen, untersucht werden. Es ist auch möglich, eine Glutamat und GABA gefüllten Pipette iontophoretischen gleichzeitig verwenden. Auf diese Weise wird die Wirkung von GABA-erge Hemmung an verschiedenen Orten relativ zu der exzitatorischen Eingang (on-Pfad, außerhalb des Weges Hemmung) untersucht werden können. Auch die Auswirkungen der Hemmung durch Interneurone auf bestimmte neuronale Domains, wie distalen Dendriten, Soma oder Axonen 14, untersucht mit GABA Iontophorese werden. In kultivierten Neuronen, bietet schnellen Mikro-Iontophorese die Möglichkeit, Investigate einzelne Synapse Verteilung und die elementaren Aspekte der Kommunikation von Synapsen in Neuronen in viel mehr Details 10,11.
In diesem Artikel zeigen wir im Detail, wie Glutamat und GABA Iontophorese für den Einsatz in akuten Hirnschnitten, die Untersuchung synaptischer Integration von erregenden und hemmenden Eingänge ermöglicht in Abhängigkeit der Eingabe Lage, Eingang Stärken und Timing, allein oder im Zusammenspiel zu etablieren. Wir weisen darauf hin, die Vorteile und Grenzen dieser Technik und wie man erfolgreich beheben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier erklären wir, wie man schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern gelten synaptischen Integration auf Dendriten zu untersuchen. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um glutamatergen und GABAergen synaptischen Übertragung in verschiedenen Hirnregionen in vitro und in vivo zu untersuchen 9,20-22. Micro-Iontophorese ist seit mehr als 60 Jahren verwendet worden, aber in den frühen Jahren war es meist verwendet, um entweder lokal gelten Neurotransmittern und Drogen bei langsam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann und Walker Jackson für das sorgfältige Lesen des Manuskripts. Die Autoren erhalten, die Finanzierung durch das Ministerium für Forschung MIWF des Landes Nordrhein-Westfalen (SR), der BMBF-Projekträger DLR deutsch-amerikanischen Zusammenarbeit in Computational Neuroscience (CRCNS; SR) zur Verfügung gestellt wurde, Centers of Excellence in Neurodegenerative Erkrankungen (COEN; SR) und der Universität Bonn intramural Förderprogramm (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
