Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç
Summary
Bu yazıda yüksek uzaysal ve zamansal hassasiyetle postsinaptik sinyal entegrasyonu araştırmak için bir teknik olarak nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez tanıtmak.
Abstract
Nörobilim temel ilgi alanlarından biri sonunda akson de aksiyon potansiyeli nöronal çıkışına yol açan dendritik ağaç, çok kompleks yapısı boyunca eksitatör ve inhibitör girdi entegrasyonu anlamaktır. Nöronal çıkış belirli sinaptik giriş farklı mekansal ve zamansal parametrelerinin etkisi dendritik girdi mesafe bağımlı zayıflama, mekansal ayrılmış giriş yerini bağımlı etkileşim, uyarıcı entegrasyonu, lineer üzerinde GABAergig inhibisyon etkisi örneğin, halen araştırılmaktadır ve doğrusal olmayan entegrasyon modları, ve çok daha fazlası.
Glutamat ve GABA hızlı mikro-iyontoforez ile tam glutamaterjik uyarma ve GABAerjik inhibisyon mekansal ve zamansal entegrasyonu incelemek mümkündür. Kritik teknik gereksinimleri ya tetiklenen floresan lamba, ışık yayan diyot (LED), ya da bir iki foton SCA olandoku önemli fotoğraf zarar tanıtan olmadan dendritik dalları görselleştirmek için mikroskop nning. Ayrıca, yüksek direnç pipetler hızlı kapasite tazminat sağlayan bir mikro-iyontoforez amplifikatör olması çok önemlidir. Başka bir önemli nokta hiçbir verici istemsiz deney sırasında pipet tarafından yayımlanan olmasıdır.
Bir kez kurulan bu tekniği yüksek bir nörotransmitter ve konumu özgüllük ile güvenilir ve tekrarlanabilir sinyalleri verecektir. Glutamat ve GABA uncaging ile karşılaştırıldığında, hızlı iyontoforez görüş alanı için sınırlama olmaksızın aynı anda ama çok uzak yerlerde hem vericileri kullanarak sağlar. Orada akson odak elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında avantajları da vardır: mikro-iyontoforez ile giriş sitenin konumu kesinlikle bilinir ve ilgi sadece nörotransmitter serbest emin olabilirsiniz. Ancak bu mikro-iyontoforez sadece dikkate alınmalıdırpostsynapse devreye girer ve nörotransmitter serbest presinaptik yönleri çözülmüş değildir. Bu yazıda beyin dilim deneylerinde mikro-iyontoforez kurmak nasıl gösterilmektedir.
Introduction
Merkezi sinir sisteminde nöronların ince ve dallanmış dendritik süreçleri 1 sinaptik çeşitli girişler almak. Orada, eksitatör dendritik girişlerin çoğunluğu glutamaterjik sinaps aracılık eder. Bu sinaps eksitatör postsinaptik potansiyeller (EPSPS) bir postsinaptik doğrusal entegrasyonu ile sonuçlanan, bir mekansal dağıtılmış şekilde devreye alınabilir. Sinaps aynı anda ve dendrit üzerine mekansal yakınlık içinde aktif ise, bu uyarıcı girişler supra-lineer entegre ve dendritik ani 2-5 oluşturmak olabilir.
Ayrıca, eksitatör girdilerin entegrasyonu dendritik ağaç üzerindeki giriş yerini bağlıdır. Distal tutam bölgede varmak sinyalleri çok daha zayıflatılmış kablo filtreleme 6 nedeniyle proksimal girişi daha vardır. Hipokampus, apikal tutam dendritler için uzak girdi proksimal dendri üzerinde daha farklı bir beyin bölgesi tarafından oluşturulantes 7. Heyecan verici bir soru bu nedenle, ne kadar sinaptik giriş farklı dendritik bölmeleri tarafından işlenen ve dendritik entegrasyon farklı şekillerde nöronal ateşleme bu katmanlı girişlerinin etkisi düzenler eğer. Edilir
Fonksiyonel özellikleri, dendrit morfolojik özellikleri Sadece, giriş yerini ve kümeleme önemlisi glutamaterjik sinaps 8,9 etkinliğini belirlemek de uyarıcı girişleri, GABAerjik terminallerinden ek inhibitör girişlerin dendritik entegrasyonu etkiliyor. Sinaptik entegrasyon Bu farklı yönlerini ideal dendritik etki için farklı nörotransmitterlerin mekansal tanımlı uygulama sağlar nörotransmitter mikro-iyontoforez, kullanılarak incelenebilir. Biz başarıyla nöronlar sinyal entegrasyon araştırmak glutamat ve GABA mikro-iyontoforez kurmak için nasıl burada göstermek.
Bu uygulama, ince uçlu içinKonsantre nörotransmitter çözeltisi ile doldurulur, yüksek direnç pipetler kullanılır. Bu pipet nörotransmiter reseptörleri bulunmaktadır hücresi, dış membran yakın konumlandırılmıştır. Dendritik dalların iyi bir görüntüleme gereklidir. Bu en iyi yama pipet vasıtasıyla tanıtılmaktadır floresan boyalar kullanılarak elde edilir. Daha sonra çok kısa bir (<1 milisaniye) akım darbesi (10 aralığında – 100 NA) şarj nörotransmitter molekülleri çıkarmak için kullanılır. Bu kısa bakliyat ve etkili kapasite tazminat ile, postsinaptik potansiyelleri veya akımlar eksitatör giriş yerini tam olarak bilinen anlamına gelir yüksek zamansal ve mekansal hassas, ile uyarılmış olabilir. Glutamat mikro iyontoforez (Şekil 1 9), burada gösterildiği gibi 6 um'den daha küçük olan bir yarıçap tanımlanabilir, sinaps aktive olabilir, ancak tek bir sinaps çözünürlük 10-12 ulaşmak da mümkündür.
Heine, M., ve ark </em> hızlı mikro-iyontoforez mekansal çözünürlükte bile düzenli glutamat 13 iki-foton uncaging ile elde nokta boyutları daha küçük olan 0.5 mikron altında boyutları, nokta ayarlanabilir gösterdi. Hızlı mikro-iyontoforez ile iki veya daha fazla iyontoforez pipetler kullanın ve dendritik ağaç üzerinde farklı, hatta uzak noktalarda yerleştirmek için kolayca mümkündür. Bu şekilde, farklı yollar gelenler de dahil olmak üzere uyarıcı etkinlik, entegrasyonu araştırılabilir. Bu, aynı zamanda, bir glutamat, GABA dolu bir iyontoforetik pipet kullanmak da mümkündür. Bu şekilde eksitatör giriş (on-yolu, off-yolu inhibisyonu) göre farklı yerlerde GABAerjik inhibisyon etkisi incelenebilir. Ayrıca, belirli nöronal etki hedef internöronlar tarafından inhibisyon etkisi, distal dendritler gibi, soma veya aksonlar 14, GABA iyontoforez kullanılarak incelenebilir. Kültürlü nöronlarda, hızlı mikro-iyontoforez INVE için bir fırsat sunuyorçok daha ayrıntılı 10,11 nöronların tek sinaps dağıtım ve sinaptik iletişim temel yönlerini stigate.
Bu yazıda giriş yeri, giriş güçlü ve zamanlama, tek başına ya da etkileşim içinde bağımlılığında eksitatör ve inhibitör girdi sinaptik entegrasyonu soruşturma sağlar akut beyin dilimleri, en kullanılmak üzere glutamat ve GABA iyontoforez kurmak için nasıl ayrıntılı olarak göstermektedir. Biz avantajları ve sınırlamaları bu tekniğin ve nasıl başarılı bir şekilde gidermek için işaret olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada dendritler üzerinde sinaptik entegrasyon araştırmak için nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez nasıl uygulanacağını açıklar. Bu teknik, başarılı bir şekilde, in vitro ve in vivo olarak 9,20-22, beynin farklı bölgelerinde ve glutamaterjik sinaptik transmisyonu GABAerjik araştırmak için kullanılmıştır. Mikro-iyontoforez 60 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır, ancak erken yıllarda çoğunlukla yerel olarak yavaş ya da ara zaman çizelgesi 23…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dikkatle el yazması okumak için Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann ve Walker Jackson teşekkür ederim. , Nörodejeneratif Hastalıklar Mükemmeliyet Merkezleri (COEN, yazarlar devlet Northrhine-Westfalia (SR), hesaplama nörobilim BMBF-Projekträger DLR ABD-Alman işbirliği (SR CRCNS) araştırma MIWF Bakanlığı tarafından sağlanan fon aldı; SR) ve Bonn intramural finansman programının Üniversitesi (BONFOR, SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
