Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции
Summary
В этой статье мы представляем быстрая микро-ионофореза нейромедиаторов как метод для исследования интеграции постсинаптических сигналов с высокой пространственной и временной точности.
Abstract
Одним из фундаментальных интересов в области неврологии, чтобы понять интеграции возбуждающих и тормозящих входов по очень сложной структурой дендритных дерева, которое в итоге приводит к выходу нейронов потенциалы действия в аксона. Влияние различных пространственных и временных параметров конкретного синаптических входных нейронов на выход в настоящее время исследуется, например, расстояние-зависимое затухание дендритных входов, расположение-зависимое взаимодействие пространственно отделены входов, влияние GABAergig ингибирование возбуждающих интеграции, линейный и нелинейный режимы интеграции, и многое другое.
С быстрым микро-электрофорез глутамат и ГАМК можно точно исследовать пространственную и временную интеграции глутаматэргическую возбуждения и ГАМК-торможения. Критические технические требования либо срабатывает лампа дневного света, светодиодные (LED), или двухфотонного SCAnning микроскоп для визуализации дендритных ветвей без введения значительных фото-повреждения ткани. Кроме того, очень важно иметь микро-электрофорез усилитель, который обеспечивает быструю компенсацию емкости высокого пипетки сопротивления. Другим важным моментом является то, что ни передатчика не невольно выпущен пипетки во время эксперимента.
Как только установлено, этот метод будет давать надежные и воспроизводимые сигналы с высокой нейротрансмиттера и расположение специфичности. По сравнению с глутамат и ГАМК uncaging, быстро ионофореза позволяет использовать оба передатчика одновременно, но в очень отдаленных местах без ограничений в поле зрения. Есть также преимущества по сравнению с координационным электрической стимуляции аксонов: с микро-электрофорез расположение входной участок точно известно и то, что только нейромедиатора интерес будет отпущена. Однако необходимо учитывать, что с микро-электрофорез толькоpostsynapse активируется и пресинаптических аспекты высвобождения нейротрансмиттеров не решен. В этой статье мы покажем, как создать микро-ионофореза в экспериментах среза мозга.
Introduction
Нейроны в центральной нервной системе получать различные синаптических входов на их тонкими и разветвленной дендритных процессов 1. Там, большинство возбуждающих входов дендритных опосредованы глутаматэргическую синапсов. Эти синапсах может быть активирована в пространственно распределенных способом, в результате чего постсинаптических линейный интеграции возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП). Если синапсы активизируются одновременно и в пространственной близости на дендритов, эти возбуждающие входы могут быть интегрированы сверх-линейно и генерировать 2-5 дендритных шипов.
Кроме того, интеграция возбуждающих входов зависит от местоположения входа на дендритных дерева. Сигналы, которые поступают в дистальной области пучок гораздо более ослабленной, чем проксимальных входов из-за кабеля фильтрацию 6. В гиппокампе далеких вклад в дендритов пучки генерируются другой регион мозга, чем те, на проксимальных dendriTES 7. Волнующий вопрос поэтому, что синаптические Ввод обрабатывается различными отсеками дендритных и если дендритных интеграции регулирует влияние этих слоистых входы нейронов по-разному.
Не только функциональные свойства, морфологические характеристики дендрита, расположение и кластеризации входы, влияющих на дендритных интеграции возбуждающих входов, а также дополнительные входы ингибирующее от ГАМКергических терминалов решающей определить эффективность глутаматэргическую синапсов 8,9. Эти различные аспекты синаптической интеграции может быть идеально исследованы с помощью нейромедиатора микро-электрофорез, что позволяет пространственно определенных применение различных нейротрансмиттеров в дендритных доменов. Мы демонстрируем здесь, как успешно установить микро-ионофореза глутамата и ГАМК расследовать интеграции сигнала в нейронах.
Для этого приложения, с острым концомвысокого сопротивления пипетки заполнены концентрированных растворов нейромедиатора используются. Эти пипетки расположены близко к наружной мембране клетки, где рецепторы нейротрансмиттеров расположены. Хорошим визуализации дендритных ветвей не требуется. Это лучше всего достигается с использованием флуоресцентных красителей, которые вводятся через патч пипетки. Затем очень короткий (<1 мс) импульса тока (в диапазоне 10 – 100 нА) используется для извлечения заряженных молекул нейромедиаторов. С помощью этих коротких импульсов и эффективной компенсации емкости, постсинаптические потенциалы или токи могут быть вызваны с высокой временной и пространственной точностью, что означает, что расположение возбуждающих входных точно известно. Глутамат микро-ионтофореза может активировать синапсов в определенный радиус, который меньше, чем 6 мкм, как показано ниже (рис. 1 9), но также можно достичь одним разрешение синапс 10-12.
Heine, М., и др. </eт> показали, что пространственное разрешение быстрого микро-электрофорез даже может быть настроен на месте размером менее 0,5 мкм, что меньше, чем размеры пятна регулярно достигнуто с двухфотонной uncaging глутамата 13. С быстрым микро-ионофореза это легко можно использовать два или более ионтофоретическая пипетки и разместить их на разных, даже далеких пятна на дендритных дерева. Таким образом, интеграция возбуждающих событий, в том числе из различных путей, могут быть исследованы. Кроме того, можно использовать глутамат и ГАМК заполненные ионтофоретическая пипетки в то же время. Таким образом, эффект ингибирования ГАМК в разных местах по отношению к возбуждающим входа (на пути, вне пути ингибирования) могут быть изучены. Кроме того, влияние ингибирования интернейроны ориентированные на конкретные нейронные доменов, как и дистальных дендритов, сомы или аксонов 14, можно исследовать с помощью ГАМК ионофореза. В культивируемых нейронах, быстрый микро-электрофорез дает возможность INVEstigate одного синапса и распределения элементарных аспектов синаптические связи нейронов в гораздо более подробно 10,11.
В данной статье мы опишем подробно, как установить глутамата и ГАМК ионтофорезом для применения в острых кусочков мозга, который позволяет исследовать синаптической интеграции возбуждающих и тормозящих входов в зависимости от расположения входа, входные сильные стороны, и сроки, самостоятельно или во взаимодействии. Мы выделим преимущества и недостатки этой методики и способы устранения успешно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь объясняется, как применять быстрые микро-ионофореза нейромедиаторов расследовать синаптической интеграции на дендритов. Этот метод был успешно использован для исследования и глутаматергические ГАМКергическими синаптической передачи в различных регионах мозга в пробирке</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ханс Райнер Polder, Мартин Fuhrmann и Уокер Джексона за внимательное прочтение рукописи. Авторы получили финансирование, которое было предоставлено Министерством исследований MIWF государства Северный Рейн-Вестфалия (SR), BMBF Projekträger DLR-американо-германского сотрудничества в вычислительной неврологии (CRCNS; SR), центрами передового опыта при нейродегенеративных заболеваниях (COEN; SR) и Боннского университета очной программы финансирования (Бонфор; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
