글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구
Summary
이 문서에서 우리는 높은 공간과 시간적 정밀도 시냅스 신호의 통합을 조사하는 기술로 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 도입을 소개합니다.
Abstract
신경 과학의 근본적인 관심사 중 하나는 결국 축삭의 행동 잠재력의 신경을 출력한다 수지상 나무의 매우 복잡한 구조를 따라 흥분성과 억제 입력의 통합을 이해하는 것입니다. 신경 세포의 출력에 대한 특정 시냅스 입력의 다양한 공간적 매개 변수의 영향은 돌기 입력의 거리에 의존 감쇠, 공간적으로 분리 된 입력의 위치에 따라 상호 작용, 흥분 통합, 선형에 GABAergig 억제의 영향을 예를 들어, 현재 조사 중입니다 비선형 통합 모드, 그리고 더 많은.
글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입으로 정확하게 글루타메이트 흥분과 GABA 성 억제의 공간적 통합을 조사 할 수 있습니다. 중요한 기술적 요구 사항 중 하나를 트리거 형광 램프, 발광 다이오드 (LED), 또는 두 광자 SCA 있습니다조직의 중요한 사진 피해를 도입하지 않고 돌기 가지를 시각화하는 현미경을 nning. 또한, 높은 저항 피펫의 빠른 용량 보정을 허용하는 마이크로 이온 도입 앰프를 가지고하는 것이 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 점은 송신기가 무의식적으로 실험 기간 동안 피펫에 의해 발표되지 않은 것입니다.
일단 설정되면,이 기술은 높은 신경 전달 물질 및 위치 특이성과 신뢰성 및 재현성 신호를 제공합니다. 글루타메이트와 GABA의 uncaging에 비해 빠른 이온 도입이 시야에 제한없이 같은 시간에하지만, 아주 먼 위치에서 두 송신기를 사용하실 수 있습니다. 이 축삭의 초점 전기 자극에 비해 장점도있다 : 마이크로 이온 도입으로 입력 사이트의 위치는 확실히 알려져있어 관심에만 신경 전달 물질이 방출되어 있는지 확인합니다. 그러나 그와 함께 마이크로 이온 도입 전용으로 간주되어야한다postsynapse이 활성화되고 신경 전달 물질 방출의 연접 양상이 확인되지 않습니다. 이 문서에서 우리는 뇌 절편 실험에서 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
중추 신경계의 뉴런은 얇은를내는 돌기 프로세스 1 시냅스 다양한 입력을받을 수 있습니다. 거기 흥분성 돌기 입력의 대부분은 글루타메이트 시냅스에 의해 매개된다. 이 시냅스는 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSPS)의 시냅스 선형 통합의 결과, 공간적으로 분산 된 방식으로 활성화 할 수 있습니다. 시냅스가 동시에 돌기에 공간 근거리에서 활성화 된 경우 이러한 흥분성 입력은 위에 선형으로 통합 돌기 스파이크 2-5을 생성 할 수 있습니다.
또한, 흥분성 입력의 통합은 수지상 나무의 입력의 위치에 따라 달라집니다. 말초 술 지역에 도착 신호가 훨씬 더 감쇠 케이블 필터링 6에 의한 근위 입력보다. 해마에서 정점 술의 돌기에 먼 입력은 인접 dendri에 비해 다른 뇌 영역에 의해 생성되는TES 7. 흥미로운 질문은 따라서, 어떻게 시냅스 입력을 다른 돌기 구획에 의해 처리하고 돌기 통합은 여러 가지 방법으로 신경 세포의 발화에서 이러한 계층 입력의 영향을 조절합니다.합니다
기능적 속성, 수상 돌기의 형태 학적 특징뿐만 아니라, 입력의 위치와 클러스터링 결정적 글루타메이트 시냅스 8,9의 효능을 결정 또한 흥분성 입력, GABA 성 터미널에서 추가 금지 입력의 돌기 통합에 영향을주지 않습니다. 시냅스 통합의 서로 다른 측면을 이상적으로 돌기 도메인에 서로 다른 신경 전달 물질의 공간적 정의 응용 프로그램을 허용 신경 전달 물질의 마이크로 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 뉴런의 신호 통합을 조사하는 글루타민산 염과 GABA의 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 여기에서 보여줍니다.
이 응용 프로그램, 뾰족한위한집중 신경 전달 물질의 솔루션으로 가득 고 저항 피펫이 사용됩니다. 이 피펫은 신경 전달 물질 수용체가있는 세포의 외부 막에 가까운 위치에 있습니다. 수지상 가지의 좋은 시각화가 필요합니다. 이 최고의 패치 피펫을 통해 도입 된 형광 염료를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 매우 짧은 (<1 밀리 초) 전류 펄스는 (10의 범위 – 100 NA) 청구 신경 전달 물질의 분자를 추출하는 데 사용됩니다. 이 짧은 펄스 및 효과적인 커패시턴스 보상, 시냅스 후 전위 또는 전류는 흥분성 입력의 위치를 정확하게 알려진 의미 높은 시간적 및 공간적 정밀도로 유발 될 수 있습니다. 글루타민산 마이크로 이온 토 포레 시스 (그림 1 9) 여기에 표시된대로 6 μm의보다 작은 정의 된 반경에 시냅스를 활성화 할 수 있지만, 단일 시냅스 해상도 10-12에 도달 할 수도 있습니다.
하이네, M., 외 </eM> 빠른 마이크로 이온 도입의 공간 해상도도 정기적으로 글루타메이트 13의 2 광자 uncaging을 달성 반점의 크기보다 작은 0.5 μm의 아래 사이즈를 발견 조정할 수 있습니다 것을 보여 주었다. 빠른 마이크로 이온 도입으로 두 개 이상의 iontophoretic 피펫을 사용하여 수지상 나무의 다른도 먼 장소에 배치 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 서로 다른 경로에서 포함 흥분성 이벤트의 통합을 조사 할 수 있습니다. 그것은 동시에 글루타민산 염과 GABA 채워진 iontophoretic 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이 방법으로 흥분성 입력 (에 경로, 오프 경로 억제)을 기준으로 서로 다른 위치에서 GABA 성 억제의 효과를 연구 할 수 있습니다. 또한, 특정 신경 도메인을 대상의 interneurons에 의한 억제 효과는 말초 돌기처럼, 소마 또는 축삭 14, GABA 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 배양 된 뉴런, 빠른 마이크로 이온 도입은 이전 inve 수있는 기회를 제공합니다더 자세한 10,11의 뉴런에서 단일 시냅스 분포와 시냅스 통신 초등학교 측면을 stigate.
이 문서에서 우리는 입력 위치 입력 강점과 타이밍, 단독으로 또는 상호 작용에의 의존에서 흥분성과 억제의 입력 시냅스 통합 조사를 허용 급성 뇌 조각에 사용하기 위해 글루타민산 염과 GABA 이온 도입을 설정하는 방법을 자세히 보여줍니다. 우리는 장점과 제한 사항이 기술을 어떻게 성공적으로 해결하는 방법을 가리 킵니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 우리가 돌기에 시냅스 통합을 조사하는 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 토 포레 시스를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 성공적으로 체외에서 생체 9,20-22 다른 뇌 영역에서 글루타메이트와 GABA 성 시냅스 전달을 조사하는 데 사용되었습니다. 마이크로 이온 토 포레 시스는 60 년 이상에 사용되고 있습니다 만, 초기에 주로 로컬 느리거나 중간 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 신중하게 원고를 읽는 한스 라이너 간척지, 마틴 마차부 워커 잭슨 감사합니다. , neurodegenerative 질병의 우수성 센터 (COEN, 저자는 국가 노스 린 – 웨스트 팔리 (SR), 전산 신경 과학 BMBF-Projekträger DLR 미국 – 독일어 협업 (SR CRCNS)의 연구 MIWF의 사역에 의해 제공되었다 자금을 받았다; SR) 및 본 교내 자금 지원 프로그램의 대학 (BONFOR, SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
