מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית
Summary
במאמר זה אנו מציגים מייקר Iontophoresis המהיר של נוירוטרנסמיטורים כטכניקה לחקור אינטגרציה של אותות postsynaptic עם דיוק מרחב ובזמן.
Abstract
אחד מהאינטרסים הבסיסיים במדעי המוח הוא להבין את האינטגרציה של תשומות מעוררות ומעכבות לאורך המבנה המורכב מאוד של העץ הדנדריטי, שסופו של דבר מוביל לפלט עצבי של פוטנציאל פעולה באקסון. ההשפעה של פרמטרים מרחב ובזמן שונים של קלט סינפטי ספציפי על פלט עצבי היא כעת תחת חקירה, למשל הנחתה מרחק תלויה בתשומות דנדריטים, האינטראקציה מיקום תלויה של מרחבית כניסות נפרדות, את ההשפעה של עיכוב GABAergig על שילוב מעורר, ליניארי ומצבים שאינם ליניארי אינטגרציה, ועוד רבים.
עם מיקרו Iontophoresis המהיר של גלוטמט וגאבא ניתן לחקור את האינטגרציה מרחב ובזמן של עירור ועיכוב glutamatergic GABAergic בדיוק. דרישות טכניות קריטיות הם או מנורת ניאון triggered, דיודה פולטת אור (LED), או SCA שני פוטוניםnning מיקרוסקופ כדי להמחיש סניפים דנדריטים ללא החדרת צילום נזק משמעותי של הרקמה. יתר על כן, זה מאוד חשוב שיהיה מגבר המייקר Iontophoresis המאפשר לפיצוי קיבול מהיר של pipettes עמידות גבוהה. הדבר חשוב נוסף הוא שלא משדר הוא שוחרר אופן לא רצוני על ידי טפטפת במהלך הניסוי.
ברגע שהוקם, טכניקה זו תיתן איתות אמינה לשחזור עם הנוירוטרנסמיטר גבוה וסגוליות מיקום. בהשוואה לגלוטמט ומשחררות רפרוף גאבא, Iontophoresis המהיר מאפשר שימוש בשתי המשדרים באותו הזמן, אבל במקומות רחוקים מאוד וללא הגבלה לשדה הראייה. יש גם יתרונות בהשוואה לגירוי חשמלי מוקדי של אקסונים: עם מיקרו Iontophoresis מיקומו של אתר הקלט בהחלט ידוע וזה בטוח שרק מוליך עצבי של עניין הוא שוחרר. עם זאת יש בו כדי להיחשב שעם מיקרו Iontophoresis בלבדpostsynapse מופעל והיבטי presynaptic של שחרור הנוירוטרנסמיטר לא נפתרו. במאמר זה אנו מדגימים כיצד להגדיר את מיקרו Iontophoresis בניסויי פרוסת מוח.
Introduction
תאי עצב במערכת העצבים המרכזית מקבלים מגוון של תשומות הסינפטי על התהליכים דנדריטים 1 הדקים ומסועפים שלהם. שם, מרבית התשומות דנדריטים המעוררות מתווכים על ידי סינפסות glutamatergic. יכולות להיות מופעלות סינפסות אלה בדרך מופצת מרחבית, וכתוצאה משילוב של פוטנציאל לינארי postsynaptic postsynaptic מעוררים (EPSPs). אם הסינפסות מופעלות בו זמנית ובקרבת מרחבי בדנדריט, ניתן לשלב תשומות מעוררות אלה הנ"ל ליניארי ולייצר 2-5 קוצים הדנדריטים.
יתר על כן, האינטגרציה של תשומות מעוררות תלויה במיקום של הקלט על העץ הדנדריטי. אותות המגיעים לאזור ציצה הדיסטלי הם הרבה יותר מוחלש מתשומות הפרוקסימלי בשל כבל סינון 6. בהיפוקמפוס, תשומות רחוקות לדנדריטים ציצת שיער apical נוצרות על ידי אזור במוח שונה מאלה על dendri הפרוקסימליTES 7. שאלה מרגשת היא אפוא, כיצד קלט הסינפטי מעובד על ידי תאי דנדריטים שונים ואם שילוב הדנדריטים מסדיר את ההשפעה של תשומות שכבות אלה על ירי עצבי בדרכים שונות.
לא רק את המאפיינים התפקודיים, תכונות מורפולוגיות של דנדריט, המיקום והקיבוץ באשכול של התשומות המשפיעים על האינטגרציה הדנדריטים של תשומות מעוררות, גם את התשומות המעכבות נוספות ממסופי GABAergic מכריע לקבוע את היעילות של סינפסות glutamatergic 8,9. היבטים שונים של אינטגרציה הסינפטי יכולים להיחקר באופן אידיאלי באמצעות מוליך עצבי המייקר Iontophoresis, המאפשר יישום מוגדר מרחבית של נוירוטרנסמיטורים שונים לתחומים דנדריטים. כאן אנו מדגימים כיצד להקים מייקר Iontophoresis של גלוטמט וגאבא הצלחה לחקור אינטגרציה אות בתאי עצב.
ליישום זה, קנס שקצהוpipettes עמידות גבוהה מלאים בפתרונות הנוירוטרנסמיטר מרוכזים משמשים. pipettes אלה ממוקמים קרוב לקרום החיצוני של התא, שבו לקולטנים העצביים נמצאים. הדמיה טובה של הענפים הדנדריטים נדרש. זו מושגת הטובה ביותר באמצעות צבעי ניאון, אשר הציגו באמצעות פיפטה את התיקון. לאחר מכן דופק קצר מאוד (<1 אלפיות השנייה) נוכחי (בטווח של 10-100 Na) משמש כדי להוציא את מולקולות מוליך העצבי הטעונות. עם פולסים קצרים אלה ופיצויים קיבול אפקטיביים, יכולים להיות התעוררות פוטנציאלים או זרמי postsynaptic עם דיוק זמן ומרחב גבוה, מה שאומר שהמיקום של הקלט מעורר ידוע במדויק. גלוטמט מייקר Iontophoresis יכול להפעיל סינפסות ברדיוס מוגדר, שהוא קטן מ 6 מיקרומטר כפי שמוצג כאן (איור 1 9), אבל זה אפשרי גם להגיע לרזולוצית סינפסה אחת 10-12.
היינה, מ ', ואח' </eמ '> הראה כי הרזולוציה מרחבית של מיקרו-Iontophoresis מהיר יכולה גם להיות מותאמת לאיתור גדלים מתחת ל -0.5 מיקרומטר, שהוא קטן יותר מגודל הנקודה שהושג באופן קבוע עם משחררות רפרוף שני פוטונים של גלוטמט 13. עם מיקרו Iontophoresis מהר זה בקלות ניתן להשתמש בשתיים או יותר pipettes iontophoretic ולמקם אותם במקומות שונים, אפילו מרוחקים על העץ הדנדריטי. בדרך זו, יכולה להיחקר אינטגרציה של אירועים מעוררים, כוללים אלה ממסלולים שונים,. כמו כן ניתן להשתמש גלוטמט ופיפטה iontophoretic מלא GABA באותו הזמן. בדרך זו ניתן ללמוד את ההשפעה של עיכוב GABAergic במקומות שונים ביחס לקלט מעורר (בנתיב, עיכוב מחוץ לנתיב). כמו כן, ההשפעה של עיכוב על ידי interneurons מיקוד תחומים עצביים ספציפיים, כמו דנדריטים דיסטלי, סומה או אקסונים 14, ניתן לחקור באמצעות Iontophoresis GABA. בנוירונים בתרבית, מיקרו Iontophoresis המהיר מציע את ההזדמנות כדי investigate הפצת סינפסה אחת ואת ההיבטים הבסיסיים של תקשורת הסינפטית בתאי עצב בפירוט רב יותר 10,11.
במאמר זה אנו מדגימים בפירוט כיצד להקים Iontophoresis גלוטמט וגאבא לשימוש בפרוסות המוח חריף, המאפשר חקירת אינטגרציה הסינפטי של תשומות מעוררות ומעכבות בתלות במיקום קלט, את נקודות החוזק של קלט, ועיתוי, לבד או ביחסי גומלין. אנו להצביע על יתרונות ומגבלות של טכניקה זו וכיצד לפתור בעיות בהצלחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נסביר איך ליישם מייקר Iontophoresis המהיר של נוירוטרנסמיטורים לחקור אינטגרציה הסינפטי בדנדריטים. טכניקה זו שימש בהצלחה לחקור שידור סינפטי glutamatergic וGABAergic באזורים שונים במוח במבחנת in vivo 9,20-22. מיקרו-Iontophoresis שימש במשך יותר מ -60 שנים, אבל בשנים הראשונות זה היה בשימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנס ריינר פולדר, מרטין פורמן ווקר ג'קסון לזהירות לקרוא את כתב היד. החוקרים קיבל מימון שהועמד על ידי משרד המחקר MIWF של מדינת Northrhine-Westfalia (SR), שיתוף הפעולה BMBF-Projekträger DLR ארה"ב לגרמניה במדעי המוח חישובית (CRCNS; SR), מרכזי התמחות במחלות ניווניות (כהן; SR), ואת האוניברסיטה של תכנית מימון בין חומות בון (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
