ग्लूटामेट और गाबा की फास्ट माइक्रो योणोगिनेसिस: Synaptic एकता की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण
Summary
इस लेख में हम उच्च स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता के साथ पोस्टअन्तर्ग्रथनी संकेतों के एकीकरण की जांच के लिए एक तकनीक के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर के तेज सूक्ष्म योणोगिनेसिस परिचय.
Abstract
तंत्रिका विज्ञान में मौलिक हितों की एक अंततः अक्षतंतु पर कार्रवाई क्षमता के neuronal उत्पादन की ओर जाता है जो वृक्ष के समान पेड़ के बहुत जटिल संरचना के साथ उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों के एकीकरण को समझने की है. न्यूरोनल उत्पादन पर विशिष्ट synaptic इनपुट के विविध स्थानिक और लौकिक मापदंडों के प्रभाव के वृक्ष के समान आदानों की दूरी पर निर्भर क्षीणन, स्थानिक अलग आदानों के स्थान पर निर्भर बातचीत, उत्तेजक एकीकरण, रेखीय पर GABAergig निषेध के प्रभाव जैसे, जांच के अंतर्गत वर्तमान में है और गैर रेखीय एकीकरण मोड, और बहुत ज्यादा है.
ग्लूटामेट और गाबा की तेज सूक्ष्म योणोगिनेसिस के साथ यह ठीक glutamatergic उत्तेजना और GABAergic निषेध के स्थानिक और लौकिक एकीकरण की जांच के लिए संभव है. क्रिटिकल तकनीकी आवश्यकताओं या तो एक ट्रिगर फ्लोरोसेंट लैंप, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), या एक दो फोटोन एससीए हैंऊतक के महत्वपूर्ण तस्वीर क्षति शुरू करने के बिना वृक्ष के समान शाखाओं कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप nning. इसके अलावा, यह उच्च प्रतिरोध pipettes के तेज समाई मुआवजे के लिए अनुमति देता है कि एक सूक्ष्म योणोगिनेसिस एम्पलीफायर होना बहुत जरूरी है. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु नहीं ट्रांसमीटर अनायास प्रयोग के दौरान पिपेट द्वारा जारी किया जाता है.
एक बार स्थापित, इस तकनीक का एक उच्च न्यूरोट्रांसमीटर और स्थान विशिष्टता के साथ विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत दे देंगे. ग्लूटामेट और GABA uncaging के मुकाबले तेजी से योणोगिनेसिस देखने के क्षेत्र के लिए सीमा के बिना एक ही समय में लेकिन बहुत दूर के स्थानों पर दोनों ट्रांसमीटर का उपयोग करने की अनुमति देता है. वहाँ axons की फोकल बिजली की उत्तेजना की तुलना में फायदे भी हैं: सूक्ष्म योणोगिनेसिस साथ इनपुट साइट का स्थान निश्चित रूप से जाना जाता है और यह केवल ब्याज की न्यूरोट्रांसमीटर जारी की है कि यकीन है. हालांकि यह उस के साथ सूक्ष्म योणोगिनेसिस ही विचार किया जाना हैpostsynapse सक्रिय है और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के प्रीसानेप्टिक पहलुओं का समाधान नहीं कर रहे हैं. इस अनुच्छेद में हम मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगों में सूक्ष्म योणोगिनेसिस स्थापित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स उनके पतले और डालियां फैला वृक्ष के समान प्रक्रियाओं 1 पर अन्तर्ग्रथनी आदानों की एक किस्म प्राप्त करते हैं. वहाँ, उत्तेजक वृक्ष के समान आदानों की बहुमत glutamatergic synapses द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. इन synapses के उत्तेजक postsynaptic क्षमता (EPSPs) के postsynaptic रेखीय एकीकरण, जिसके परिणामस्वरूप एक spatially वितरित तरह से सक्रिय किया जा सकता है. Synapses के एक साथ और dendrite पर स्थानिक निकटता में सक्रिय कर रहे हैं, तो इन उत्तेजक आदानों सुप्रा रैखिक एकीकृत और वृक्ष के समान स्पाइक्स को 2-5 उत्पन्न किया जा सकता है.
इसके अलावा, उत्तेजक आदानों के एकीकरण के वृक्ष के समान पेड़ पर इनपुट के स्थान पर निर्भर करता है. बाहर का गुच्छा क्षेत्र में आने का संकेत है कि बहुत अधिक तनु केबल छानने 6 के कारण समीपस्थ आदानों की तुलना कर रहे हैं. हिप्पोकैम्पस में, शिखर गुच्छा डेन्ड्राइट को दूर आदानों समीपस्थ dendri पर उन लोगों की तुलना में एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र द्वारा उत्पन्न कर रहे हैंtes 7. एक रोमांचक सवाल इसलिए है, कैसे synaptic इनपुट अलग वृक्ष के समान डिब्बों से संसाधित और वृक्ष के समान एकीकरण अलग अलग तरीकों से neuronal फायरिंग पर इन स्तरों पर होती आदानों के प्रभाव को नियंत्रित करता है. है
कार्यात्मक संपत्तियों, डेन्ड्राइट का रूपात्मक सुविधाओं इतना ही नहीं, आदानों के स्थान और क्लस्टरिंग महत्वपूर्ण glutamatergic synapses 8,9 की प्रभावकारिता निर्धारित भी उत्तेजक आदानों, GABAergic टर्मिनलों से अतिरिक्त निरोधात्मक आदानों के वृक्ष के समान एकीकरण प्रभावित कर रहे हैं. अन्तर्ग्रथनी एकीकरण के इन विभिन्न पहलुओं आदर्श वृक्ष के समान डोमेन के लिए अलग न्यूरोट्रांसमीटर के स्थानिक परिभाषित आवेदन की अनुमति देता है जो न्यूरोट्रांसमीटर सूक्ष्म योणोगिनेसिस, का उपयोग कर जांच की जा सकती है. हम सफलतापूर्वक न्यूरॉन्स में संकेत एकीकरण की जांच के लिए ग्लूटामेट और गाबा की सूक्ष्म योणोगिनेसिस स्थापित करने के लिए कैसे यहाँ प्रदर्शित करता है.
इस आवेदन, ठीक इत्तला दे दी के लिएकेंद्रित न्यूरोट्रांसमीटर समाधान के साथ भरा उच्च प्रतिरोध pipettes का उपयोग किया जाता है. ये pipettes न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स स्थित हैं जहां सेल, की बाहरी झिल्ली के करीब तैनात हैं. वृक्ष के समान शाखाओं का एक अच्छा दृश्य के लिए आवश्यक है. यह सबसे अच्छा पैच विंदुक के माध्यम से पेश कर रहे हैं जो फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कर हासिल की है. फिर एक बहुत ही कम (<1 मिसे) वर्तमान नाड़ी (10 की रेंज में – 100 एनए) का आरोप लगाया न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं बेदखल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन कम दालों और प्रभावी समाई मुआवजा के साथ, postsynaptic क्षमता या धाराओं उत्तेजक इनपुट का स्थान ठीक से जाना जाता है जिसका अर्थ है उच्च अस्थायी और स्थानिक परिशुद्धता के साथ पैदा किया जा सकता है. ग्लूटामेट सूक्ष्म योणोगिनेसिस (चित्रा 1 9) जैसा कि यहाँ दिखाया 6 माइक्रोन से छोटी है, जो एक परिभाषित त्रिज्या में synapses सक्रिय कर सकते हैं, लेकिन यह एक अन्तर्ग्रथन संकल्प 10-12 तक पहुंचने के लिए भी संभव है.
हेन, एम, एट अल </eमीटर> तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस के स्थानिक संकल्प भी नियमित रूप से ग्लूटामेट 13 के दो photon uncaging के साथ प्राप्त स्थान आकार से छोटी है, जो 0.5 माइक्रोन से नीचे आकार, हाजिर करने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि पता चला है. तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस के साथ यह दो या अधिक iontophoretic pipettes का उपयोग करें और वृक्ष के समान पेड़ पर अलग है, यहां तक कि दूर के स्थानों पर उन्हें जगह आसानी से संभव है. इस तरह, अलग रास्ते से उन सहित उत्तेजक घटनाओं, के एकीकरण की जांच की जा सकती है. यह एक ही समय में एक ग्लूटामेट और एक गाबा भरे iontophoretic पिपेट का उपयोग करने के लिए भी संभव है. इस तरह उत्तेजक इनपुट (पर पथ, ऑफ पथ अवरोध) के सापेक्ष विभिन्न स्थानों पर GABAergic निषेध के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, विशिष्ट neuronal डोमेन को लक्षित interneurons द्वारा अवरोध का प्रभाव, बाहर का डेन्ड्राइट तरह, सोमा या axons 14, गाबा योणोगिनेसिस का उपयोग कर जांच की जा सकती है. सभ्य न्यूरॉन्स में, तेजी से सूक्ष्म योणोगिनेसिस inve करने का अवसर प्रदान करता हैबहुत अधिक विस्तार 10,11 में न्यूरॉन्स में एक synapse के वितरण और synaptic संचार के प्राथमिक पहलुओं stigate.
इस लेख में हम इनपुट स्थान, इनपुट ताकत है, और समय, अकेले या परस्पर क्रिया में की निर्भरता में उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों की synaptic एकीकरण की जांच की अनुमति देता है जो तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में उपयोग के लिए ग्लूटामेट और GABA योणोगिनेसिस स्थापित करने के लिए कैसे विस्तार में प्रदर्शित करता है. हम फायदे और सीमाएं इस तकनीक का और कैसे सफलतापूर्वक निवारण करने के लिए बात करेंगे.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम डेन्ड्राइट पर synaptic एकीकरण की जांच के लिए न्यूरोट्रांसमीटर की तेजी सूक्ष्म योणोगिनेसिस लागू करने के लिए समझाना. इस तकनीक को सफलतापूर्वक इन विट्रो और इन विवो 9,20-22 में अलग मस्तिष्क क्षेत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ध्यान से पांडुलिपि पढ़ने के लिए हंस रेनर Polder, मार्टिन Fuhrmann और वाकर जैक्सन धन्यवाद. , neurodegenerative रोगों में उत्कृष्टता के केंद्र (कोएन, लेखकों राज्य Northrhine-Westfalia (एसआर), कम्प्यूटेशनल न्यूरोसाइंस में BMBF-Projekträger डीएलआर अमेरिका जर्मन सहयोग (एसआर CRCNS) के अनुसंधान MIWF मंत्रालय द्वारा प्रदान किया गया है कि धन प्राप्त किया; एसआर), और बॉन अंदर का वित्त पोषण कार्यक्रम के विश्वविद्यालय (BONFOR, एसआर).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
