زراعة وصيانة<em> المطثية العسيرة</em> في بيئة لاهوائية

Summary

المطثية العسيرة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي هي احيوائية صارمة ويسبب الإسهال المضادات الحيوية المرتبطة بها (AAD). هنا، طرق عزل، زراعة والحفاظ على C. وصفت الخلايا والجراثيم الخضري صعب. هذه التقنيات يحتم على غرفة اللاهوائية، الأمر الذي يتطلب صيانة دورية لضمان الظروف المناسبة لأفضل C. زراعة صعب.

Abstract

المطثية العسيرة هو، اللاهوائية، البكتيريا إيجابية الجرام مولد الأبواغ التي هي المسؤولة في المقام الأول عن المضادات الحيوية المرتبطة الاسهال (AAD) وهو الممرض المستشفيات كبيرة. C. صعب أمر بالغ الصعوبة لعزل وزراعة وحساس للغاية حتى مستويات منخفضة من الأوكسجين في البيئة. هنا، وأساليب لعزل C. صعب من عينات البراز وزراعة احقا C. يتم عرض صعب لإعداد مخزون الجلسرين للتخزين على المدى الطويل. وكما وصفت تقنيات لإعداد وتعداد الأسهم بوغ في المختبر لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك المصب المجهري والدراسات على الحيوانات. هذه التقنيات يحتم على غرفة اللاهوائية، والتي تحافظ على البيئة اللاهوائية متسقة لضمان الظروف المناسبة لأفضل C. النمو صعب. نحن نقدم بروتوكولات لنقل المواد داخل وخارج الغرفة دون كاليفورنياباستخدام تلوث الأكسجين كبيرة جنبا إلى جنب مع اقتراحات للصيانة العادية المطلوبة للحفاظ على البيئة اللاهوائية المناسبة لكفاءة ومتسقة C. زراعة صعب.

Introduction

المطثية العسيرة هو، بكتيريا تشكيل بوغ الغرام الإيجابية التي هو احيوائية تلزم والممرض الجهاز الهضمي قاتلة للبشر والحيوانات. وصفت في البداية في عام 1935 كما كائن المتعايشة وجدت في عينات البراز من الأطفال حديثي الولادة ^1، C. وقد تجلى صعب في وقت لاحق أن يكون العامل المسبب لالتهاب القولون الغشائي الكاذب المرتبطة العلاج بالمضادات الحيوية ^2. C. وعادة ما يسبق الالتهابات صعب (CDI) عن طريق العلاج بالمضادات الحيوية مما يؤدي إلى اختلال النباتات القولون العادية، وخلق مكانة لC. صعب أن تزدهر ^2. C. تبث صعب باعتبارها بوغ نائمة من طريق البراز إلى الفم، وتنبت في وقت لاحق داخل القناة الهضمية، وإنتاج الخلايا النباتية قادرة على توليد العديد من السموم وتسبب أمراض شديدة والتهاب القولون ^3. CDI غالبا ما تكون العلاجات التقليدية لصهر وهذه فيوكثيرا ما تكرر ذكر fections ^4. ونتيجة لذلك، CDI هي مسؤولة عن ما يصل إلى 4.8 مليار دولار في تكاليف الرعاية الصحية في الولايات المتحدة الأمريكية ^5-7.

C. صعب حساس جدا لحتى مستويات منخفضة من الأوكسجين في البيئة. لC. صعب أن تستمر في البيئة وأن تنتقل بكفاءة من المضيف إلى المضيف، وتشكيل بوغ غير نشط أيضي حرجة ^8. لأن صيانة المختبرات والتلاعب C. يتطلب صعب بيئة اللاهوائية التي تسيطر عليها، هذه التقنيات تتطلب استخدام حجرة اللاهوائية. وقد أدى استخدام غرف اللاهوائية في زيادة الانتعاش والعزلة من اللاهوائيات تلزم ^9-11، وسمحت لعدد من التقنيات الجزيئية التي يتعين القيام بها في جو اللاهوائية.

بالإضافة إلى C. صعب، واستخدام غرفة اللاهوائية والصيانة وصفها هنا قابلة للتطبيقلاللاهوائيات تلزم أخرى مثل الأنواع الأخرى اللاهوائية (مثل المطثية الحاطمة)، والأنواع الأخرى الهضمي (مثل الأنواع باكتيرويديز ¹²⁾ ومسببات الأمراض اللثة (مثل الأنواع الهضمونية العقدية ^13).

Protocol

ملاحظة: C. صعب هو الممرض الإنسان والحيوان التي يمكن أن تسبب أمراض الجهاز الهضمي. التجارب التي تنطوي على C. صعب يجب القيام بها مع احتياطات السلامة الأحيائية المناسبة (BSL-2). 1. اللاهوائية غرفة الاستخدام والصيانة <p class="jove_content…

Representative Results

مثال على C. صعب نمت على BHIS وكولومبيا اللاهوائية الأغنام وسائل الإعلام أجار الدم يمكن أن ينظر إليه في الشكل 2. C. صعب تشكل مستعمرات غير النظامية التي هي شقة وتمتلك مظهر من الزجاج الأرضي الذي هو واضح على كل وسائل الإعلام. هنا، وهو عزل السريرية للC. ا?…

Discussion

الأساليب المذكورة هنا يسمح للانتعاش بسيط وسريع للC. صعب من مجموعة متنوعة من عينات البراز، بما في ذلك البشر والفئران والهامستر، فضلا عن التخزين الطويل الأمد للC. صعب كما الجلسرين أو بوغ الأسهم. C. صعب يمكن أن يكون كائن من الصعب زراعة، ولكن صيانة حذرا من بي?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
ᴅ-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
ᴅ-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
			Materials
			TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.