Het kweken en onderhouden<em> Clostridium difficile</em> In een anaëroob milieu

Summary

Clostridium difficile is een pathogene bacterie die een strikt anaerobe en veroorzaakt antibiotica geassocieerde diarree (AAD). Hier, werkwijzen voor het isoleren, kweken en onderhouden C. difficile vegetatieve cellen en sporen worden beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die regelmatig onderhoud nodig heeft om te zorgen voor een goede voorwaarden voor een optimale C. difficile teelt.

Abstract

Clostridium difficile is een Gram-positieve, anaërobe, sporogenic bacterie die primair verantwoordelijk is voor antibiotica geassocieerde diarree (AAD) en is een belangrijke nosocomiale pathogenen. C. difficile is notoir moeilijk te isoleren en cultiveren en is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Hier, werkwijzen voor het isoleren C. difficile van fecale monsters en vervolgens het kweken van C. difficile voor de bereiding van glycerol bestanden langetermijnopslag gepresenteerd. Technieken voor het bereiden en het opsommen spore aandelen in het laboratorium voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals microscopie en dierlijke studies beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die een consistente anaëroob milieu te zorgen voor een juiste omstandigheden voor een optimale C. onderhoudt difficile groei. Wij bieden protocollen voor de overdracht van materialen in en uit de kamer zonder camet behulp van aanzienlijke verontreiniging zuurstof samen met suggesties voor regelmatig onderhoud nodig om de juiste anaëroob milieu te ondersteunen voor een efficiënte en consistente C. difficile teelt.

Introduction

Clostridium difficile is een grampositieve, sporenvormende bacterie die een obligaat anaërobe en een potentieel fatale gastrointestinale pathogenen van mensen en dieren. Aanvankelijk beschreven in 1935 als een commensaal organisme gevonden in fecale monsters van pasgeborenen ^1, C. difficile werd later aangetoond dat de verwekker van pseudomembraneuze colitis geassocieerd met antibiotica ² zijn. C. difficile infecties (CDI) worden gewoonlijk voorafgegaan door antibiotische behandeling die resulteert in de verstoring van de normale darmflora, het creëren van een nis voor C. difficile te gedijen ^2. C. difficile als een slapende spore via de fecaal-orale weg overgebracht en vervolgens ontkiemt in het maagdarmkanaal, vegetatief cellen kan genereren verscheidene toxine en veroorzaken ernstige ziekte en colitis ^3. CDI zijn vaak ongevoelig voor conventionele behandelingen en deze infections worden vaak terugkerende ^4. Daardoor CDI zijn verantwoordelijk voor $ 4,8 miljard aan gezondheidszorgkosten in de Verenigde Staten ^5-7.

C. difficile is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Voor C. difficile te blijven in het milieu en efficiënt worden overgedragen van gastheer naar gastheer, de vorming van een metabolisch inactieve spore is van cruciaal belang ^8. Omdat het laboratorium onderhoud en manipulatie van C. difficile is een gecontroleerde, anaëroob milieu, deze technieken vereisen het gebruik van een anaërobe kamer. Gebruik van anaërobe kamers heeft geleid tot een toegenomen terugwinning en isolatie van obligate anaerobe ^9-11, en ​​heeft geleid tot een aantal moleculaire technieken in een anaërobe atmosfeer worden uitgevoerd.

Naast C. difficile, de anaërobe kamer gebruik en onderhoud hier beschreven toepassingandere obligate anaerobe bacteriën zoals Clostridium andere soorten (bijv. C. perfringens), andere maag-soorten (bijvoorbeeld Bacteroides soorten ¹²⁾ en periodontale pathogenen (bv. Peptostreptococcus species ^13).

Protocol

Opmerking: C. difficile is een menselijke en dierlijke ziekteverwekker die gastro-intestinale aandoeningen kunnen veroorzaken. Experimenten met C. difficile moet worden uitgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen bioveiligheid (BSL-2). 1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud C. difficile is een strikt anaërobe en is zeer gevoelig voor zelfs lage concentraties van zuurstof in de atmosfeer. Daarom wordt een gecontroleerde, anaëroob mi…

Representative Results

Een voorbeeld van C. difficile geteeld op BHIS en Columbia schapen anaërobe agar media kan worden gezien in figuur 2. C. difficile vormt onregelmatige kolonies die plat zijn en beschikken over ingeslepen verschijning die duidelijk op beide media. Hier, een erytromycine gevoelige klinisch isolaat van C. difficile, 630E 30, wordt gekweekt op agar BHIS een verrijkte, niet-selectief medium gedurende 24 uur bij 37 ° C (Figuur 2A). Kolonies op Columbia …

Discussion

De hier beschreven methoden is het mogelijk voor een eenvoudige en snel herstel van C. difficile uit verschillende fecale monsters, waaronder mensen, muizen en hamsters, alsmede de opslag van C. langdurige difficile glycerol of spore voorraden. C. difficile kan een moeilijke organisme te kweken, maar zorgvuldig onderhoud van een anaëroob milieu en de toepassing van aseptische technieken voor robuuste groei en een vermindering van verontreiniging.

Anaërobe k…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
ᴅ-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
ᴅ-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
			Materials
			TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.