배양 및 유지<em> 클로 스트 리듐 디피</em> 혐기성 환경에서
Summary
클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.
Abstract
클로 스트 리듐 디피 항생제 관련 설사 (AAD)의 주된 책임이며 중요한 병원 내 병원체 그람 양성, 혐기성, sporogenic 세균이다. C. 남과 어울리지 분리 및 배양하는 악명 어려운 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. 여기에, C.를 분리하는 방법 대변 샘플에서 어울리지 이후에 배양 C. 장기 저장을위한 글리세롤 주식의 준비를위한 어울리지이되게됩니다. 현미경과 동물 연구 등의 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 실험실에서 포자 주식을 준비하고 열거하는 기술도 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 일관성있는 혐기성 환경을 유지하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 성장. 우리는 CA없이 챔버 안팎으로 물질을 전달하기위한 프로토콜을 제공한다효율적이고 일관성있는 C.에 해당하는 혐기성 환경을 유지하기 위해 필요한 정기적 인 유지 보수에 대한 제안과 함께 중요한 산소 오염을 사용하여 남과 어울리지 재배.
Introduction
클로 스트 리듐 디피는 의무를 혐기성 미생물과 인간과 동물의 잠재적으로 치명적인 위장 병원체 그람 양성, 포자를 형성하는 박테리아입니다. 처음에는 신생아 1, C.에서 배설물 샘플에서 발견 공생 생물로 1935 년에 설명 어울리지는 나중에 항생제 치료 2와 관련된 위 막성 대장염의 원인 물질로 증명되었다. C.에게 남과 어울리지 않는 감염 (CDI)는 일반적으로 C에 대한 틈새 시장을 창조하는 정상 결장 식물의 중단 결과 항생제 치료가옵니다 어울리지 2 번창한다. C. 어울리지는 분변 – 경구 경로를 통해 휴면 포자로 전송 이후에 여러 가지 독소를 생성하고 심각한 질병 및 대장염 3을 일으킬 수있는 식물 세포를 생산, 위장 내에서 발아한다. CDI는 종종 기존의 치료와 이들의에 불응fections 자주 4를 반복합니다. 그 결과, CDI는 미국 5-7 의료 비용의 최대 48억달러에 대한 책임이 있습니다.
C. 남과 어울리지 않는 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. C.에 대한 어울리지 않는 환경에서 지속하고 효율적으로 호스트에 호스트로부터 전송, 대사 적으로 비활성 포자의 형성이 중요 8입니다. 때문에 C.의 실험실 유지 및 조작 어울리지 이러한 기술은 혐기성 챔버의 사용을 필요로, 제어, 혐기성 환경이 필요합니다. 혐기성 챔버의 사용은 증가 된 회복 의무를 혐기성 9-11 단리 초래하였으며, 혐기성 분위기에서 수행 될 분자 기술의 수가 허용했다.
C. 외에도 어울리지는 여기에 설명 된 혐기성 챔버의 사용 및 유지 보수가 적용됩니다같은 다른 클로스 트리 디움 종 (예를 들면 C. 퍼프 린 젠스), 다른 위장 종 (예를 들어 테로이 12 종) 및 치주 병원균 (예 Peptostreptococcus 종 13) 등의 의무를 혐기성 균에.
Protocol
참고 : C. 어울리지 위장 질환을 일으킬 수있는 인간과 동물의 병원체이다. C. 관련된 실험 어울리지 적절한 바이오 안전성주의 사항 (BSL-2)으로 수행해야합니다. 1. 혐기성 실 사용 및 유지 보수 C. 남과 어울리지 않는 엄격한 혐기성 미생물과 대기 중의 산소도 낮은 농도에 매우 민감하다. 따라서, 제어, 혐기성 환경은 성공적인 ?…
Representative Results
C.의 예 BHIS 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천 매체에 성장 어울리지는 그림 2에서 볼 수 있습니다. C. 어울리지는 평면이며 모두 미디어에 분명하다 지상 유리 외관을 가지고 불규칙한 식민지를 형성한다. 여기에, C.의 에리스로 마이신에 민감한 임상 분리 남과 어울리지 않는, 630E (30)는 37 ° C (그림 2A)에서 24 시간 동안, BHIS 한천, ?…
Discussion
여기에서 설명하는 방법은 C의 간단하고 신속하게 복구 할 수 인간, 마우스, 햄스터, C. 등의 장기 저장을 포함한 분변 시료의 다양한에서 디피 글리세롤 또는 포자 주식으로 어울리지. C. 어울리지 경작하기 어려운 유기체가 될 수 있지만주의 혐기성 환경의 유지 보수 및 무균 기술의 응용 프로그램은 강력한 성장과 오염의 감소를 제공 할 수 있습니다.
<p class="jove_step…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 친절하게 혐기성 챔버의 사진을 제공 수줍어 연구소에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강 보조금 DK087763 (SMM) 및 STEP / HHMI 교육 과정 개발 원정대 (ANE)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
References
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Cite This Article
Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).