Summary

La culture et entretien<em> Clostridium difficile</em> Dans un environnement anaérobie

Published: September 14, 2013
doi:

Summary

Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d'isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.

Abstract

Clostridium difficile est un anaérobie, bactérie à Gram positif sporogène qui est principalement responsable de la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA) et est un agent pathogène nosocomial important. C. difficile est notoirement difficile à isoler et à cultiver et est extrêmement sensible à même les niveaux d'oxygène dans l'environnement faibles. Ici, les procédés d'isolement de C. difficile à partir d'échantillons fécaux et la culture de la suite C. difficile pour la préparation des stocks de glycérol pour le stockage à long terme sont présentés. Des techniques pour la préparation et l'énumération des stocks de spores dans le laboratoire pour une variété d'applications en aval, y compris des études de microscopie et animaux sont également décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui maintient un milieu anaérobie cohérente afin de garantir des conditions adéquates pour optimale C. croissance difficile. Nous fournissons des protocoles pour le transfert de matériaux dans et hors de la chambre sans caen utilisant une contamination importante de l'oxygène ainsi que des suggestions pour l'entretien régulier nécessaire pour préserver l'environnement anaérobie approprié pour efficace et cohérente C. culture difficile.

Introduction

Clostridium difficile est une bactérie sporulée Gram positif qui est un anaérobie strict et un agent pathogène gastro-intestinal potentiellement mortelle de l'homme et les animaux. Initialement décrit en 1935 comme un organisme commensal trouvé dans les échantillons de selles des nouveau-nés 1, C. difficile a été démontré plus tard d'être l'agent causal de la colite pseudomembraneuse associée à un traitement antibiotique 2. C. infections difficile (ICD) sont généralement précédés par un traitement antibiotique qui se traduit par la perturbation de la flore colique normale, la création d'une niche pour C. difficile de prospérer 2. C. difficile est transmis sous forme d'une spore dormante par l'intermédiaire de la voie fécale-orale et par la suite germe dans le tractus gastro-intestinal, la production de cellules végétatives capable de générer plusieurs toxines et provoquer une maladie grave et la colite 3. CDI sont souvent réfractaires aux traitements conventionnels et ceux-ci enperfections sont souvent récurrentes 4. En conséquence, le CDI sont responsables de jusqu'à 4,8 milliards de dollars en coûts de soins de santé aux États-Unis 5-7.

C. difficile est très sensible même pour les niveaux d'oxygène dans l'environnement de faibles. Pour C. difficile de persister dans l'environnement et être efficacement transmis d'hôte à hôte, la formation d'une spore métaboliquement inactif est critique 8. Étant donné que le maintien et la manipulation de laboratoire de C. difficile nécessite un environnement anaérobie contrôlée, ces techniques nécessitent l'utilisation d'une chambre anaérobie. L'utilisation de chambres d'anaérobie a abouti à la récupération accrue et l'isolement des anaérobies stricts 9-11, et a permis un certain nombre de techniques moléculaires devant être exécutés dans une atmosphère anaérobie.

En plus de C. difficile, l'anaérobie utilisation de la chambre et l'entretien décrits ici sont applicablesà d'autres anaérobies stricts tels que d'autres espèces de Clostridium (par exemple C. perfringens), d'autres espèces gastro-intestinaux (par exemple, les espèces Bacteroides 12) et pathogènes parodontaux (par exemple, les espèces Peptostreptococcus 13).

Protocol

Remarque: C. difficile est un agent pathogène humain et animal qui peut provoquer une maladie gastro-intestinale. Les expériences impliquant C. difficile doit être effectué avec des précautions appropriées de biosécurité (BSL-2). Une. Anaérobie Chambre utilisation et d'entretien C. difficile est une bactérie anaérobie stricte et est extrêmement sensible à de faibles concentrations d'oxygène dans l'atmosphère. Pa…

Representative Results

Un exemple de C. difficile cultivé sur BHIS Britannique et anaérobie moutons milieux de gélose au sang peut être vu sur la figure 2. C. difficile forme des colonies irrégulières qui sont à plat et possèdent un aspect de verre dépoli qui est évident sur ​​les deux médias. Ici, un isolat clinique érythromycine sensible de C. difficile, 630E 30, est cultivé sur gélose BHIS, un milieu non sélectif enrichi, pendant 24 heures à 37 ° C (Figure …

Discussion

Les méthodes décrites ici permettent de récupération simple et rapide de C. difficile à partir d'une variété d'échantillons de matières fécales, y compris les humains, les souris et les hamsters, ainsi que le stockage à long terme de C. difficile comme le glycérol ou spores des stocks. C. difficile peut être un organisme difficile à cultiver, mais une maintenance rigoureuse d'un environnement anaérobie et l'application des techniques d'asepsie peut prévoir u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Coy laboratoires pour fournir aimablement des photos de la chambre anaérobie. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé subvention DK087763 (SMM) et un curriculum STEP / HHMI développement de la fraternité (ANE).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
ᴅ-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
ᴅ-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

References

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Cite This Article
Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

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